CAPITOLO 3: MATERIALI E METODI

CAPITOLO 3: MATERIALI E METODI

3.1 Biologia molecolare

3.1.1 Realizzazione dei costrutti

Per la produzione del costrutto vettore realizzato siamo partiti dal p34TF10, un clone molecolare di FIV contenente l’intero genoma dell’isolato Petaluma dal quale è stato rimosso il codone di stop situato in Orf-A alla posizione 6122.

Abbiamo sostituito la regione U3 all’LTR al 5’ con il promotore CMV, al fine di garantire un’espressione costitutiva del vettore anche in cellule eterologhe. Il promotore CMV è stato amplificato per PCR dal plasmide pcDNA3 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)

Per la PCR sono stati utilizzati 10 ng di campione aggiunti alla miscela di reazione costituita da deossinucleotidi 0,2 mM, 20pmoli di ciascun primer, 1 unità di enzima Taq DNA polimerasi (Polymed, Firenze) per ogni campione nel buffer specifico 1X contenente MgCl2 1.5X.

I primer utilizzati sono pCMV-S (Tab.1), che contiene il siti di taglio per l’enzima di restrizione PshAI, e CMV/R-AS (Tab.1). Quest’ultimo possiede, oltre ad una sequenza specifica per la porzione terminale del CMV, una sequenza aggiuntiva al 5’ corrispondente al frammento iniziale della regione R dell’LTR di FIV.

La reazione di PCR è suddivisa in più fasi:

• Una denaturazione iniziale del DNA per 2 minuti a 94°C • Una serie di 25 cicli in cui si ha

1. denaturazione a 94°C 30’’

3. estensione a 72°C per un tempo che dipende dalla lunghezza del frammento

• estensione finale di 5-7 minuti a 72°C.

In parallelo è stata effettuata un’analoga reazione di PCR a partire dal p34TF10 utilizzando i primer CMV/R-S e U5 AS (Tab.1). Il primer senso si appaia alla porzione iniziale della regione R e ha una coda aggiuntiva al 5’ per la porzione terminale del CMV.

Gli amplificati delle due PCR sono stati controllati su gel di agarosio all’1% contenente Bromuro d’Etidio che, intercalandosi tra le basi del DNA, ne permette la visione ai raggi UV.

Il DNA è stato in seguito purificato dai sali di reazione mediante precipitazione con 1/10 di volume di sodio acetato 3M a pH 5,2 e 2-3 volumi di etanolo assoluto freddo. La precipitazione è stata effettuata lasciando il campione per 2-3 ore a –80°C o a –20°C overnight.

La reazione è stata, quindi, centrifugata a 4°C per 30 minuti a 12000 rotazioni per minuto (rpm) e, dopo aver lavato il pellet con etanolo al 70%, si è effettuata un’altra centrifugazione per 10 minuti a 12000 rpm a 4°C. Alla fine il DNA è stato asciugato, risospeso in H2O e quantificato approssimativamente mediante corsa su gel di agarosio.

A questo punto i due amplificati, che hanno una regione complementare comprendente la porzione finale del CMV e l’inizio di R, sono stati uniti in una terza reazione di PCR e, in presenza dei primer pCMV-S e U5-AS, si è generato il frammento finale di circa 1050 bp che presenta all’estremita 5’ il sito di taglio per PshAI e nella regione terminale della regione U5 quello per SacI (Fig 3.1). L’amplificato finale così ottenuto è stato digerito con 50 unità di ciascun enzima in presenza del buffer specifico NE Buffer 4 (Biolabs) 1X e della BSA. La reazione è incubata per 2-3 ore a 37°C e il frammento digerito, di 660 bp, è stato purificato tramite estrazione da banda, dopo una corsa su gel di agarosio allo 0,8%, usando il Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Milano). Il DNA è stato, quindi, eluito in H2O e nuovamente quantificato su gel.

5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ Amplificazione 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ No Amplificazione pcDNA3

CMV

pcDNA3 pCMV-S CMV/R-AS

U3

R

U5

5’UTR SacI CMV/R-S U5-AS PshAI

CMV

PshAI

R

U5

5’UTR SacI 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Amplificazione 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ No Amplificazione pcDNA3

CMV

pcDNA3 pCMV-S CMV/R-AS

U3

R

R

U5

U5

5’UTR SacI CMV/R-S U5-AS PshAI

CMV

PshAI

R

U5

R

U5

5’UTR SacI

Figura 3.1: Strategia di PCR utilizzata per il clonaggio del promotore CMV nel plasmide p34TF10. I segmenti in fucsia rappresentano le regioni complementari dei frammenti.

Per la rimozione della regione U3 del 5’LTR, sono stati digeriti 10 µg di plasmide p34TF10 con gli enzimi PshAI (posizione 105 sulla flankling al 5’) e SacI (nucleotide 507 del p34TF10) producendo un frammento di 620 bp. Quest’ultimo frammento è stato precipitato per eliminare i sali della reazione di digestione e defosforilato con 1 unità di Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (Promega Italia, Milano) per µg di DNA in Buffer SAP 1X (Promega Italia, Milano).

La reazione è stata mantenuta per 30 minuti a 37°C e poi a 65°C per 15 minuti per disattivare gli enzimi. Il plasmide e l’amplificato sono stati, infine, ligati utilizzando l’enzima T4 DNA ligasi (MBI Fermentas, Milano). Lo screening del DNA ricombinante è stato fatto mediante PCR con i primer pCMV S e U3RII AS (Tab.1) che producono un frammento 770 bp solo se il CMV è presente al posto dell’LTR; questo costrutto è stato denominato CMV∆ORF (Fig 3.2).

igura 3.2: costrutto CMV∆ORF

er la produzione del costrutto SIN, è stato necessario deletare una regione

questa delezione, a partire dal plasmide iniziale p34TF10, è

reazione sono stati utilizzati i primer TM scr S e DU3 AS generando un frammento di 685 bp, mentre nella seconda sono stati usati i

gag pol _vif

orf-A rev

env RRE

U3 R U5 CMV R U5

gag pol _vif

orf-A rev env RRE U3 R U5 U3 R U5 CMV R U5 F P

di 130 bp dal nucleotide 9190 al 9320, comprendente le regioni AP4, AP1 e la TATA box.

Per effettuare

stata allestita una strategia basata su due PCR iniziali attarverso le quali sono state amplificate separatamente le regioni a monte e a valle di quella da deletare.

primer DU3 S e PUC AS (circa 425 bp) (Tab.1). I primer DU3 S e DU3AS hanno la particolarità di essere in parte complementari per la presenza di una coda aggiuntiva al 5’ che contiene anche il sito di restrizione per l’enzima NotI (MBI Fermentas, Milano).

I due amplificati ottenuti, sono stati purificati tramite estrazione da banda su gel d’agarosio e utilizzati come campione in una terza reazione di PCR,

ono stati digeriti con gli enzimi AsuII (MBI Fermentas,

è stato

rito con

r cui i campioni buoni nella quale i due frammenti, che si appiano grazie alla regione complementare, in presenza dei primer TM scr S e PUC AS, hanno generato il frammento finale di circa 1300 bp in cui è mancante la porzione interessata dell’U3.

Dopo purificazione tramite estrazione da banda, sia l’amplificato che il plasmide CMV∆ORF s

Milano), e SalI (New England Biolabs, Milano), presente sul plasmide di clonaggio pUC119, in Buffer Y+ _{Tango 1X (MBI Fermentas, Milano).}

A seguito di un’incubazione di 2-3 ore a 37°C e una disattivazione dell’enzima AsuII di 20 minuti a 80°C, il costrutto CMV∆ORF

precipitato, risospeso in 15µl di H2O e defosforilato. L’inserto è stato estratto da banda e ligato al CMV∆ORF generando il costrutto SIN (Fig 3.3).

Lo screening per verificare la bontà del costrutto è stato effettuato sia per digestione che per PCR. Nel primo caso il vettore è stato dige

l’enzima BlpI (New England Biolabs, Milano) in NE Buffer 4 (Biolabs) 1X più BSA, e, poiché con la delezione all’U3 è stato perso anche il sito di taglio di questo enzima, il costrutto SIN non è stato digerito.

Nel secondo caso è stato utilizzato il primer LTR221 S (Tab.1), che si appaia a livello della regione deleta, e il primer PUC AS, pe

NotI

orf-A rev

gag pol _{vif env}

RRE

R U5 CMV R U5

AP4 AP1 AP4 ATF TATAbox

SIN

NotI

orf-A rev

gag pol _{vif env}

RRE

R U5 CMV R U5

AP4 AP1 AP4 ATF TATAbox

SIN

Figura 3.3: Costrutto SIN

Per realizzare il costrutto finale, è stata deleta la regione compresa tra il nucleotide 750 (nell’ORF gag) e il nucleotide 8650 (nell’ORF env).

In tal modo sono state mantenute 120 bp di gag contenenti parte della regione di incapsidamento (Browning et al., 2003) e la sequenza RRE importante per l’export nucleare. Le restanti parti dei geni gag, pol ed env sono state, invece, delete con una strategia a tre PCR analoga a quella utilizzata per realizzare il SIN in cui i primer utilizzati che presentano una regione complementare sono Gag-rre S e Gag-rre AS (Tab.1).

Per la prima reazione sono stati utilizzati i primer IN S (Tab.1) e Gag-rre AS con i quali si è amplificato una regione di 470 bp compresa tra l’U5 e le prime 120 bp di gag e che presenta al 3’ una parte della sequenza dell’RRE aggiunta dal primer antisenso.

La seconda regione, amplificata con i primer Gag-rre S e LPCR AS (Tab.1), ha dato origine a un frammento di 443 bp che comprende la sequenza RRE e una piccola porzione di gag, grazie alla coda al 5’ portata dal primer senso.

Gli amplificati ottenuti dalle prime due reazioni sono stati purificati tramite estrazione da banda e usati come campioni nella PCR finale in cui i primer utilizzati sono stati IN S e LPCR AS. Poiché la regione complementare dei due amplificati era di 63 bp il frammento finale ottenuto è di 850 bp.

Per aumentare la quantità di amplificato finale ottenuta, una parte del prodotto di PCR è stato clonato nel plasmide di espressione pCR II presente nel kit TA cloning Dual Promoter (Invitrogen, Milano) che permette un

rapido clonaggio dell’amplificato grazie alla presenza nel vettore di residui di deossitimidina che si legano a quelli di deossiadeosina inseriti dalla taq polimerasi durante la reazione di amplificazione. Il frammento inserito interrompe la sequenza codificante per la β-galattosidasi e questo garantisce un veloce screening blu/bianco delle colonie buone dopo trasformazione di cellule specifiche fornite dal kit.

Attraverso questa strategia sono stati recuperati circa 2.5 µg di amplificato finale che sono stati digeriti insieme al vettore SIN. Sono stati utilizzati gli enzimi di restrizione SacI (New England Biolabs, Milano) e Asu II che hanno prodotto rispettivamente tre frammenti di 200 bp, 500 bp e 140 bp nell’amplificato e due frammenti di 3400 bp e 8600 bp nel vettore.

In seguito a purificazione tramite precipitazione e a defosforilazione del vettore, il frammento da 3400 bp è stato ligato a quello da 500 bp e il costrutto ottenuto, denominato SIN Gag-rre (Fig. 3.4), è stato controllato attraverso due PCR con due diverse coppie di primer: Gag-rre S/TM scr AS e TM scr S/TM scr AS (Tab.1).

Dalla prima reazione, come ci si attendeva, è stato ottenuto un frammento di 80 bp, mentre nella seconda non si è avuta amplificazione perché TM scr S si appaia ad una regione dell’env che è stata deleta con la realizzazione del costrutto. CMV R U5 Gag RRE R U5 SIN Not1 CMV R U5 Gag RRE R U5 SIN Not1 R U5 SIN Not1

Figura 3.4: Costrutto SIN Gag-rre

Nel vettore è stato successivamente inserito un polylinker costituito dai siti di restrizione di ClaI, SacII, BlpI, KpnI, PacI. A questo scopo sono stati costruiti due primer denominati MCS S e MCS AS (Tab.1), che oltre ad avere regioni complementari alla sequenza del costrutto SIN Gag-rre, contengono le sequenze specifiche per gli enzimi.

Il frammento ottenuto per PCR è stato digerito insieme al SIN Gag-rre con gli enzimi AsuII e NotI (MBI Fermentas, Milano) e i prodotti di reazione sono stati ligati dopo purificazione dai sali di digestione dando origine ad un vettore di 5380 bp denominato SIN-MCS (Fig. 3.5).

Lo screening è stato effettuato tramite doppia digestione utilizzando un enzima presente nel vettore (SacI) e uno sul polylinker (SacII).

CMV R U5 Gag RRE R U5

SIN

Not1 MCS

ClaI SacII BlpI KpnI PacI

CMV R U5 Gag RRE R U5 SIN Not1 MCS CMV R U5 Gag RRE R U5 SIN Not1 R U5 SIN Not1 MCS

ClaI SacII BlpI KpnI PacI

Figura 3.5: Costrutto SIN-MCS

All’interno del polylinker è stata inserita la cassetta di espressione costituita dal promotore costitutivo CMV e un gene reporter codificante per la green fluorescent protein (GFP). Per il clonaggio è stata fatta una digestione del vettore SIN-MCS con gli enzimi del polylinker ClaI e SacII, parallelamente è stato digerito con gli stessi enzimi un vettore contenente la cassetta CMV-GFP già presente in laboratorio. Il frammento contenente la cassetta d’espressione, prodottosi con questa seconda digestione, è stato purificato e ligato al SIN-MCS precedentemente digerito e defosforilato. Con quest’ultima inserzione è stato prodotto il costrutto finale SIN CMV-GFP di 6680 bp illustrato un Fig 4.1, sezione Risultati con il quale sono stati trasfettati i diversi istotipi cellulari.

Per realizzare il secondo costrutto, SIN cPPT siamo partiti dal SIN CMV-GFP. La sequenza contenente il cPPT è stata amplificata partendo dal plasmide p34TF10 e utilizzando i primer cPPT S e cPPT AS (Tab.1) che contengono anche il sito di restrizione di ClaI, utilizzato per digerire il frammento una volta amplificato. Il cPPT S contiene anche il sito di restrizione per ApaI che può essere utilizzato per altri eventuali clonaggi.

Anche il vettore SIN CMV-GFP è stato digerito con ClaI (Amersham Pharmacia Biotech, Milano) e dopo purificazione e defosforilazione è stata

fatta la ligation tra quest’ultimo e il frammento amplificato, digerito ed estratto da banda. Attraverso questa procedura, la sequenza cPPT è stata inserita tra l’RRE e la cassetta CMV-GFP.

L’utilizzo di un unico sito di restrizione per il clonaggio fa si che il frammento possa inserirsi sia in senso che in antisenso; per questo motivo è stato necessario effettuare uno screening specifico per PCR in cui si è valutato sia la presenza dell’inserto sia il suo inserimento nel verso corretto.

A questo scopo sono stati utilizzati un primer esterno (Gag-rre S) e uno interno al cPPT (cPPT AS) che hanno prodotto un frammento di 527 bp solo nel caso in cui l’inserto si sia legato al vettore nella maniera corretta. Lo schema del costrutto definitivo è illustrato in Fig. 4.2 sezione Risultati

3.1.2 Ligation

Gli amplificati purificati e quantificati sono stati utilizzati in reazioni di ligation che ne hanno permesso la circolarizzazione attraverso la formazione di un legame fosfodiesterico tra il fosfato presente all’estremità 5’ e il gruppo ossidrile all’estremità 3’.

Si sono utilizzati 100-200 ng di plasmide e una quantità di inserto che può variare da un rapporto molare di 1:5 a 1:30 in funzione delle dimensioni dell’inserto.

La reazione è catalizzata dall’enzima T4 DNA ligasi in volume di reazione di 20 µl contenente: il plasmide e l’inserto nelle quantità stabilite, 5 U di enzima nel suo tampone di reazione specifico.

Dopo incubazione overnight della miscela a 16°C, l’enzima viene disattivato portando la temperatura a 65°C per 10 minuti.

3.1.3 Trasformazione

I prodotti di ciascuna ligation sono stati utilizzati per trasformare il ceppo JM109 di E.coli reso competente nel nostro laboratorio e conservato in

aliquote da 200 µl a –80°C. Tutte le trasformazioni sono state eseguite aggiungendo 10-100 ng di DNA plasmidico alla soluzione contenente i batteri e lasciando incubare la miscela in ghiaccio per 30 minuti.

Dopo l’incubazione le cellule sono sottoposte a shock termico tenendole per 45 secondi a 42°C, in modo da alterare la permeabilità della membrana plasmatica e favorire l’entrata del DNA, e trasferite rapidamente in ghiaccio per 2 minuti.

A questo punto ciascuna miscela viene posta in agitazione per un’ora a 37°C, previa aggiunta di 1 ml di terreno SOC (2% Triptone, 0,5% di estratto di lievito, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10mM e glucosio 20 mM).

Le cellule vengono infine piastrate sul terreno LB–agar (10g Triptone, 5g/l di estratto di lievito, 10 g/l NaCl a pH 7,0, 1,5% di agar) a cui è stata aggiunta ampicillina 50 µg/ml che, essendo l’antibiotico di selezione presente nel plasmide pUC119, permette la crescita soltanto alle cellule che hanno acquisito il plasmide.

Poiché non è possibile discriminare le colonie che hanno assunto il plasmide richiuso da quelle che lo hanno acquisito ricombinante, talvolta viene eseguita una PCR di screening direttamente sulle colonie.

Il profilo di amplificazione è identico a quello utilizzato per le altre PCR, ma è necessario portare la denaturazione iniziale a 95°C per 10 minuti in modo da lisare i batteri e favorire la liberazione del DNA nella miscela.

3.1.4 Estrazione dei plasmidi

Per effettuare l’estrazione del DNA, le colonie selezionate sono state fatte crescere overnight a 37°C in 2 ml di terreno liquido LB addizionato con ampicillina 50 µg/ml e il DNA è stato estratto attraverso una lisi alcalina. A questo scopo 1.5 ml di coltura sono stati sedimentati centrifugando per 5 minuti a 12000 rpm a 4°C. Una volta eliminato il surnatante, il pellet è stato risospeso in 100 µl di soluzione I (glucosio 50 mM, 25mM Tris HCl a pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0). Per la lisi della parete sono stati aggiunti 200 µl di

soluzione II alcalina (0,2N NaOH, 1%SDS) e 150 µl di soluzione III neutralizzante (3M potassio acetato, 5M acido acetico). Dopo un’incubazione di 3-5 minuti in ghiaccio, il lisato batterico è stato centrifugato 5 minuti a 12000 rpm a 4°C e il surnatante, contenente il DNA plasmidico, è stato trasferito in un tubino nuovo. Per eliminare le proteine contenute nel surnatante è stato aggiunto un volume di fenolo/cloroformio seguito da centrifugazione a 12000 rpm a 4°C per 5 minuti.

La centrifugazione porta alla formazione di due fasi, quella inferiore contenente fenolo/cloroformio, quella superiore contenente il DNA che è stato prelevato e precipitato con l’aggiunta di 0.7 volumi di isopropanolo seguita da una centrifugazione di 15 minuti a 12000 rpm.

Dopo un lavaggio con 100-200 µl di etanolo al 70% e un’ultima centrifugazione a 12000 rpm per 5 minuti è stato aspirato il surnatante e il pellet, una volta asciugato, è stato risospeso in 20 µl di H2O e Rnasi A (un decimo del volume). La Rnasi A è stata lasciata agire per 30 minuti a 37°C. Per ottenere una quantità di materiale maggiore, le colonie sono state cresciute in 50 ml di LB addizionato con ampicillina 50 µg/ml e il DNA è stato estratto secondo il protocollo Midi plasmid Kit (Qiagen gmbH, Hilden, Germany). Dopo l’estrazione il DNA è stato controllato su gel d’agarosio e quantificato allo spettrofotometro misurando la densità ottica (O.D.) alla lunghezza d’onda 260 nm, dalla quale è ricavabile la concentrazione dell’acido nucleico in ng/µl.

3.1.5 Determinazione della sequenza di DNA

Al fine di determinare la corretta inserzione di ogni frammento ed escludere la presenza di mutazioni nel costrutto, al termine di ogni clonaggio è stata determinata la sequenza del vettore.

A questo scopo è stata usata una tecnica di sequenziamento basata sul metodo di terminazione della catena di Sanger. La tecnica prevede la sintesi di catene di DNA di diversa lunghezza complementari al DNA stampo presente nella miscela di reazione. La diversa lunghezza dei frammenti è

dovuta all’utilizzo, nella reazione di sequenza, oltre che di deossinucleotiditrifosfato (dNTPs) anche dei loro analoghi dideossinucleotidi (ddNTPs), che, mancando del gruppo ossidrile al 3’, arrestano la catena quando vengono incorporati durante la polimerizzazione.

La reazione è catalizzata da una DNA polimerasi-DNA dipendente che utilizza come innesco un primer marcato con un fluorocromo all’estremità 5’ (Cy5’).

La reazione di sequenza per ogni campione viene condotta in quattro tubini ognuno dei quali contiene solo uno dei 4 ddNTPs. In questo modo si ottengono 4 serie di molecole, ognuna della quali terminante con una delle quattro basi, ma aventi tutte un oligonucleotide marcato rappresentato dal primer al 5’.

All’inizio viene allestita una miscela di reazione di 13 µl con 2 µl di primer marcato (senso o antisenso), una quantità di DNA templato corrispondente a circa 100 ng, e acqua a volume. Contemporaneamente vengono preparati i 4 tubini ognuno contenente una miscela di reazione (ThermoSequenaseTM primer Cycle sequencing kit, Amersham Pharmacia, Biotech, Milano), costituita da un tampone di reazione, DNA polimerasi, dNTPs e un diverso ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddUTP).

Dalla miscela iniziale vengono aliquotati 3 µl in ciascun tubino e si procede alla reazione di amplificazione costituita da 25 cicli in cui si alternano 3 fasi:

• denaturazione a 95°C per 25’’

• annealing alla temperatura del primer per 30’’ • estensione a 72°C per 1 minuto.

Terminata la reazione vengono aggiunti in ciascun tubino 6 µl di una soluzione denaturante contenente formammide fornita dal kit; si incuba per 3 minuti a 72°C e si pone immediatamente in ghiaccio per evitare la rinaturazione dei frammenti.

I quattro amplificati vengono, a questo punto, caricati su gel di poliacrilammide, nelle 4 corsie per singolo clone, corrispondenti ai relativi nucleotidi. La corsa elettroforetica dei frammenti viene analizzata da un

sequenziatore automatico: Automatic Laser Fluorescence (A.L.F.) DNA sequencer (Amersham Pharmacia, Biotech, Milano).

Lo strumento è costituito da un’unita elettroforetica, in cui alloggia il gel immerso nel tampone di corsa TBE 1X (TBE 5X: 54 g/l Tris base, 27,5 g/l acido borico, 20 ml/l 0,5M EDTA pH 8,0), presenta un laser, nella parte inferiore del gel, che decorre parallelamente alla linea dei pozzetti. Il gel utilizzato alla concentrazione finale del 7% è ottenuto mescolando una soluzione A contenente acrilammide/bisacrillamide e una soluzione B contenente TBE 1X, agente denaturante e iniziatore ai raggi UV, entrambe fornite dal ReproGelTM _{Long Read Kit (Amersham Pharmacia, Biotech,} Milano).

Il gel viene lasciato per 10 minuti sotto l’azione dei raggi UV che, favorendo al formazione dei legami crociati tra acrilammide e bisacrilammide, consentono la polimerizzazione.

Durante la migrazione i frammenti raggiungono il laser in tempi diversi a seconda della loro lunghezza. Quando ciò accade, il laser eccita il fluorocromo determinando un segnale luminoso che viene registrato dal computer sotto forma di picco.

Alla fine si ottengono una serie di picchi per ognuna delle 4 corsie, e in seguito alla elaborazione dei dati attraverso un software viene determinata la sequenza completa del frammento.

I primer di sequenza utilizzati per i diversi clonaggi sono indicati nella tabella 1.

Sequenza da 5’ a 3’ tccgacaccggtcgtacgggccagatatacg gggttctctagttagcccctcaacaaagagactcc ggctaactagagaacccgaggagtctctttgttgagg acttgattatgagctcgatgctgcttcactag actgtccctcggcgaatctcctg tgaaataataatggcatagaacaaaataatg acttgactacgtactggcggccgcttggtccagatgtgaaacttcgaggagtctcttt tctggaccaagcggccgccagtacgtagtcaagtatcatttgttcgtaaacagtcccta gttagctcactcattaggcacc cctaaccgcaaaaccacatcc ttcagatgggccattagaatgtaggagtgttattattgattttatgtttaccta aaacataaaatcaataataacactcctacattctaatggcccatctgaaattcccttctccaa tttacctgtgaggtctcggaatccgggccgagaacttcgcagttggcgcccgaacaggacttgattgagagtgattgag gctgtctcccgttgtagaagtcg gtgtatcctagtatcttgtgga atcgatccgcggctaagcggtaccttaattaacacgacttctacaacgggagacagcacagtagattctgaa ttaattaagggtaccgcttagccgctcgatccaaatacgttcctgaagcgatcttctaactctgtcatcatc gtccatcgatgggccctagtctcaattttaaaagaagagg cggtagctaccactgtgcttgcaatttttgtgg Cy5-agggggatgtgctgcaagg Cy5-cggtagtaacagtctgga Cy5-ggaggttcatcttcagaatctac Cy5-gcaatgcctgaagtagaaggag

Nome primer PCMV S CMV/R AS CMV/R S U5-AS U3RII AS TM scr S DU3 S DU3 AS PUC AS LTR221 S Gag RRE S Gag RRE AS IN S LPCR AS TM scr AS MCS S MCS AS cPPT S cPPT AS Fla-Eco Fla-Bam Seq MCS AS Seq RevII S Tabella 1

: Primer utilizzati per clonaggio e

3.2 Biologia cellulare

3.2.1 Cellule

Tutti gli istotipi cellulari utilizzati per la caratterizzazione dei due costrutti vettore sono cellule aderenti mantenute in coltura a 37°C in atmosfera umidificata, con il 5% di CO2 in terreno DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) addizionato con 10% di FCS (siero fetale bovino), 1% di glutammina, 1% di streptomicina e 1% di penicillina.

Per l’espansione delle cellule, al raggiungimento della confluenza, viene rimosso il terreno e dopo un lavaggio con PBS (PBS 10X: 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 14,4 g di Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, HCl a pH 7,4) le cellule vengono staccate con tripsina (Eurobio, Francia). Le piastre sono lasciate per qualche minuto a 37°C per permettere alla tripsina di agire, viene poi aggiunto il terreno in rapporto 1:5 (tripsina:terreno) perché il siero contenuto all’interno è in grado di disattivare l’enzima.

Le cellule vengono, poi, sedimentate tramite centrifugazione a 1200 rpm per 7 minuti e, dopo aver eliminato il surnatante e risospeso il pellet, sono nuovamente seminate in opportune diluizioni in nuove piastre.

3.2.2 Trasfezione con il metodo del calcio fosfato

La produzione dei due vettore realizzati è stata fatta mediante cotrasfezione dei costrutti di packaging, VSV-G e vettore su CrFK e 293T.

Ventiquattro ore prima di effettuare la trasfezione 2,5X106 _{cellule sono state} trasferite in piastre da 100mm per colture cellulari contenenti in totale 10 ml di terreno DMEM + 10% FCS.

La quantità di cellule è stata scelta in modo tale che al momento della trasfezione si abbia una confluenza del 60-80%. Alcune ore prima della trasfezione il terreno è stato sostituito con terreno fresco. La quantità di DNA utilizzata per la trasfezione è di 20 µg distribuita in rapporto

equimolecolare tra i tre costrutti e, in particolare, in rapporto 1:3:6 VSV-G, packaging, costrutto vettore. Il DNA è stato precipitato secondo il protocollo descritto nel §3.1 e risospeso in 450 µl di buffer TE (Tris 1 mM, EDTA 0.1 mM) a pH 8.0 fino a completa solubilizzazione. A questi sono stati poi aggiunti 500 µl di HEPES (280 mM NaCl, 10mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4, 12mM destrosio, 50 mM Hepes) e, successivamente, 50 µl di cloruro di calcio (CaCl2 250 mM).

Dopo aver miscelato fino a completa omogeneizzazione della soluzione, è stata fatta un’incubazione di 20-30 minuti ed in seguito la soluzione contenente DNA è stata distribuita uniformemente goccia a goccia sulla piastra contenente le cellule da trasfettare.

Dopo 6-7 ore dalla trasfezione il terreno è stato nuovamente sostituito con terreno fresco.

3.2.3 Trasduzione

Il giorno precedente la trasduzione, 6X104_{/pozzetto CrFk e 293T sono state} seminate in piastre da 24 pozzetti contenenti ciascuna 1ml di terreno DMEM + 10% di FSC.

A quarantotto ore dalla trasfezione il surnatante delle CrFK e delle 293T trasfettate è stato raccolto, chiarificato mediante centrifugazione a 1500 rpm per 7 minuti e filtrato con filtri del diametro di 0,45 µm.

Per concentrare il vettore presente nel surnatante sono state utilizzate due procedure distinte.

• Polilisina: per favorire la precipitazione del vettore virale sono stati aggiunti 250 µl di L-polilisina ogni 10 ml di terreno e, dopo aver mescolato per inversione, si è lasciato incubare per 30 minuti a 4°C. In seguito è stata effettuata una centrifugazione di 2 ore a 10000 rpm al termine della quale è stato eliminato il surnatante

• Ultracentrifuga: 24 ore prima della prova, i tubini utilizzati sono stati lavati con etanolo al 70%, sciacquati con H2O sterile e lasciati asciugare sotto cappa. I tubini sono stati poi riempiti con il surnatante chiarificato e ultracentrifugati per 2 ore a 24000 rpm. In entrambi i casi, una volta terminata la centrifugazione, il pellet contenente il vettore è stato risospeso in 1 ml di terreno DMEM addizionato di FCS e interamente inoculato sulle cellule da trasdurre.

3.2.4 Dosaggio immunoenzimatico della proteina p25

Uno dei parametri utilizzati per valutare l’efficienza di trasfezione e trasduzione dei due costrutti vettore è stata la rivelazione e la quantificazione della proteina p25 di FIV sfruttando due anticorpi monoclonali rivolti verso due epitopi diversi (Lombardi et al., 1994). A tale scopo è stato utilizzato un test di tipo immunoenzimatico (ELISA) a sandwich, che prevede l’immobilizzazione della proteina tra i due anticorpi. L’anticorpo anti-p25 DF3 è satto incubato overnight a temperatura ambiente in piastre Probind (Falcon, italia), alla concentrazione di 0,25 µg/pozzetto in 100 µl di tampone sodio carbonato a pH 9,6 (Na2CO3 1,59 g/l, NaHCO3 2,93 g/l NaN3 0,2 g/l). Il giorno successivo è stato effettuato il post-coating per saturare la superficie del pozzetto aggiungendo 100µl/pozzetto di skim milk al 1% in PBS ed incubando per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo l’incubazione, sono stati fatti 6 lavaggi in PBS e sono stati aggiunti 100 µl di campione e 10 µl di tampone di lisi (Tween 20 0,5%, Triton 5%, PBS) ad ogni pozzetto. Dopo 2 ore di incubazione a temperatura ambiente sono stati aggiunti 100 µl/pozzetto dell’anticorpo DF10 biotinilato diluito 1:4000 in PBS-Tween con skim milk 1% e FCS inattivato 0,5%. Dopo 1 ora di incubazione a temperatura ambiente sono stati aggiunti in ogni pozzetto 100 µl di anticorpo anti-biotina (Sigma, St. Louis, USA) coniugato con l’enzima perrossidasi, diluito 1:1000 in PBS-Tween, 1% di skim milk. Dopo un’ulteriore incubazione di 1 ora, è stato aggiunto 100 µl di substrato

tetrametilbenzedina (TMB)-H202 in rapporto 1:1 per la rivelazione. Dopo 7 minuti la reazione è stata bloccata mediante aggiunta di H2SO4 1 N (50 µl/pozzetto). E’ stata fatta la lettura dell’assorbanza mediante processore ELISA (Behring) ad una lunghezza d’onda di 450 nm. Sono stati considerati positivi i campioni che hanno mostrato valori di O.D. maggiori di 5 volte la media dei valori assunti dai controlli negativi o comunque per valori superiori a 0,05.

3.2.5 Lettura al citofluorimetro

Questo saggio è stato utilizzato per valutare l’efficienza di trasfezione e la percentuale di cellule trasdotte basandoci sull’espressione del gene reporter GFP presente in entrambi i costrutti prodotti.

A vari tempi le cellule da usare per la lettura sono state staccate con tripsina, è stato effettuato un lavaggio con FACS buffer (2g BSA 0,2%, 1g Sodio azide 0,1%, PBS), seguito da centrifugazione di 7 minuti a 1200 rpm, è stato eliminato il surnatante e le cellule risospese sono state fissate con FACS FiX (50 ml FACS buffer, 500mg paraformaldeide 1%). L’analisi al FACS (FACScan, Necton Dickinson) è stata eseguita sfruttando la metodica della citofluorimetria a flusso.

I dati sono stati interpretati andando ad osservare lo spostamento delle cellule esprimenti GFP verso valori più alti di fluorescenza rispetto alle cellule di controllo.