UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PISA
Facoltà Scienze Matematiche Fisiche e Naturali
Corso di Laurea Specialistica in Scienze e Tecnologie Biomolecolari
TESI DI LAUREA SPECIALISTICA
Caratterizzazione funzionale di
Djmot,
un gene omologo a
“mortalin/mthsp70/GRP75”
nelle planarie
Candidato Relatore
Laura Gioia Passione Prof.ssa Renata Batistoni
Indice
Riassunto 1
Abstract 2
INTRODUZIONE 3
1. LE PLANARIE: UN SISTEMA MODELLO PER STUDIARE LA
RIGENERAZIONE 4
2. RIGENERAZIONE NELLE PLANARIE 7
2.1 LA “CHIAVE” DELLA RIGENERAZIONE: I NEOBLASTI 8
3. METOLOGIE RECENTEMENTE APPLICATE AGLI STUDI SULLE
PLANARIE 12
4. LE HEAT SHOCK PROTEIN (HSPs) 14
5. LA MORTALINA: UN MEMBRO PECULIARE DELLA FAMIGLIA HSP 70 15
6. SCOPO DELLA TESI 19
MATERIALI E METODI 20
1. Animali 21
2. Irraggiamento con raggi X 21
3. Estrazione di RNA totale 21
4. Isolamento del gene Djmot
4.1 Isolamento di Djmot mediante RT-PCR
4.2 Djmot: 5’/3’ RACE Rapid amplification of cDNA end)
22 22 22
5. Eluizione da gel e purificazione dei prodotti di PCR 23
6. Clonaggio del DNA amplificato in vettori plasmidici 24
7. Trasformazione di cellule competenti 24
8. Estrazione del DNA plasmidico
8.1 Mini Prep “sporche”
8.2 Mini Prep “pulite”
8.3 Midi Prep
24 24 25 25
9. Digestione del DNA plasmidico mediante enzimi di restrizione 26
10. Sintesi di sonde ad RNA 26
11. Sintesi del double-strand RNA (dsRNA) 27
12. Iniezione di dsRNA in D. japonica 28
13. Ibridazione in situ “whole mount” 29
14. Inclusione in paraffina 30
15. Ibridazione in situ e immunoistochimica “su sezioni” 31
RISULTATI 33
1. Caratterizzazione del gene Djmot 34
2. Espressione di Djmot in planarie intatte e rigeneranti 39
3. Coinvolgimento di Djmot nella risposta all’irraggiamento mediante raggi X 41
4. Espressione di Djmot sotto condizioni di stress 42
5. Esperimenti funzionali basati sulla metodeica di RNA interference (RNAi) 44
6. Cosa succede ai neoblasti dopo Djmot RNAi? 46
DISCUSSIONE 48
I geni hsp 70 nelle planarie: Djmot 49
Ringraziamenti 54
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI 55
