3. Risultati e Discussione
Come già anticipato, l’obbiettivo di questa Tesi è stata la sintesi dei due mimici disaccaridici a struttura β-D-ManNAc-(1→4)-DNJ (25) e β-D-GlcNAc-(1→4)-DNJ (26), al
fine di saggiare la loro attività nei confronti dei recettori delle cellule NK e verificare la possibilità di stabilire, attraverso il confronto con gli agonisti già testati, delle valutazioni sulla relazione fra struttura molecolare ed attività biologica.
Figura 14 NH O O OH O H O H OH O H OH NHAc NH O O OH O H O H OH O H OH NHAc 25 β− β− β− β−ManNAc-(1 >4)-DNJ 26 β− β− β− β−GlcNAc-(1 >4)-DNJ
Fra le possibili strade sintetiche è stata scelta quella basata sulla trasformazione di un disaccaride disponibile da fonti naturali, in un mimico in cui la DNJ risulta β-glicosilata in 4 con le due esosammine, ManNAc (25) e GlcNAc (26), evitando lo step di glicosidazione. I due più comuni disaccaridi a giunzione β-(1→4) sono il cellobiosio [β-Glc-(1→4)-Glc], ottenuto per idrolisi controllata della cellulosa, e il lattosio [β-Gal-(1→4)-Glc], il più abbondante ed economico disaccaride naturale, presente in quantità variabile (4-7% g/L) nel latte dei mammiferi. Questo secondo disaccaride è addirittura più economico di molti dei più comuni solventi, in quanto viene prodotto in grande quantità (stimata in circa 800.000 ton/anno) dal siero del latte, prodotto di scarto dell’industria lattiero-casearia.
Nel Laboratorio dove ho svolto la Tesi è stato accumulata negli ultimi due decenni una vasta esperienza sulla chimica del lattosio, mettendo a punto numerose sintesi di carboidrati difficilmente accessibili da fonti naturali, basandosi su un concetto abbastanza semplice. E’ stato, cioè, considerato il lattosio o come un semplice glucopiranoso sostituito in posizione 4 con un gruppo β-D-galattopiranosidico, oppure come un β-D-galattopiranoside avente come
aglicone un residuo glucopiranosico. Nell’ipotesi che una delle due unità monosaccaridiche sia completamente protetta, sarà possibile applicare all’altra unità tutte le possibili manipolazioni chimiche della chimica dei carboidrati (ossidazioni, epimerizzazioni, amminazioni, ecc.). Ugualmente sarebbe possibile applicare ad una sola delle due unità tutte quelle reazioni che, a causa delle differenze strutturali fra i due monosaccaridi, avvengano in maniera completamente chemoselettiva su uno solo di essi. Questa semplificazione richiede, per aver validità, una totale o, comunque molto avanzata, protezione con gruppi
sufficientemente stabili, dell’una o dell’altra unità monosaccaridica, in modo da poter considerare, all’occorrenza, come sostituente la porzione non interessata.
Proseguendo su questo ragionamento, i processi sintetici necessari per trasformare il lattosio nei due mimici azadisaccaridici 25 e 26, richiedono, basandoci sull’esperienza maturata nella sintesi di β-D-Gal-(1→4)-DNJ (40)14 e β-D-TalNAc-(1→4)-DNJ8 (24), i seguenti quattro processi. Il primo si basa sulla realizzazione di un’efficiente differenziazione delle due unità monosaccaridiche, che determini la completa protezione dell’unità riducente di
D-glucosio e la protezione differenziata in 6, 3 e 4 dell’unità β-D-galattopiranosidica,
accedendo ad un precursore di tipo 50 (Schema 9). La seconda fase per arrivare ai precursori dei due targets, prevede in ambedue i casi l’epimerizzazione al C-4 ed un’amminazione in 2 con inversione di configurazione, per accedere ad un derivato ManNAc (51) o con formale ritenzione per ottenere il nucleo di GlcNAc (52).
Schema 9 OH O OH O O OH OH O H O H OH O H OP1 O OP OR OH PO P1O O OP OR NP P2O P1O O OP OR NP P2O lattosio (39) 51 52 50
Una volta realizzate queste trasformazioni, la terza fase prevede l’elaborazione dell’unità di D-glucosio, sostituita in 4 dalle due diverse unità β-esosamminiche, con l’obiettivo di realizzare un’ossidazione regioselettiva del gruppo alcolico in 5 (Schema 10) ottenendo derivati del D-xilo-esos-5-ulosio (54a,b). Il quarto, ed ultimo, processo (Schema 10) sarà la doppia amminazione riducente (amminociclizzazione) del derivato 1,5-dicarbonilico con formazione del nucleo di DNJ, β-glicosilata in 4 con l’opportuna esosammina, da cui, dopo deprotezione finale si otterranno i due targets 25 e 26.
Schema 10 RO O OH OH O H O H RO O H O H OH O CHO RO NH OH OH O H 54a, b 53a,b 25: R = ββββ-D-ManNAc
26: R = ββββ-D-GlcNAc a: R = ββββ-D-ManNAc; b: R = βββ-D-GlcNAcβ
51, 52
La presentazione e la discussione dei risultati della Tesi saranno, quindi, riportati seguendo l’ordine logico delle 4 sequenze sopra descritte.
3.1. - Protezione differenziata delle unità monosaccaridiche del lattosio
Un metodo molto efficiente di differenziazione delle due unità monosaccaridiche costituenti il lattosio è stato sviluppato nel Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, sede Chimica Bioorganica e Biofarmacia (Pisa), sottoponendo il lattosio ad una doppia reazione di acetonazione con 2,2,-dimetossipropano (DMP) promossa da quantità catalitiche di acido p-toluensolfonico (TsOH).16 La prima acetonazione prevede un trattamento a caldo (80°C) di una soluzione di lattosio (39) in un largo eccesso di DMP, che funziona, quindi, da solvente e agente acetonante (Schema 11). Dopo 12 ore, il prodotto di partenza risulta scomparso (Rf 0,
esano-AcOEt 2:3) mentre si notano due prodotti principali, attribuibili al triacetonlattosio dimetilacetale (56, Rf 0.26) ed al suo 6’-metossiisopropil derivato (55, Rf 0.47). I due
poliacetonuri derivano, oltre che dalla formazione dei gruppi isopropilidenici e, nel caso di 55, anche di quello acetalico misto, da reazione di acetalazione fra il gruppo aldeidico dell’unità riducente del D-glucosio con il metanolo che si libera nelle isopropilidenazioni con
DMP. Il rapporto fra i due acetonuri 55 e 56 è, in questo primo step di acetonazione, a favore del secondo, per un rapporto di circa 3:2.
Schema 11 OH O OH O O OH OH OH O H OH O H CMe2 O O CMe2 O O (MeO)2CH OGlc O O Me2C O OH OC(OMe)Me2 OGlc O O Me2C O OH OH 39 55 Glc = 1) TsOH, DMP, 80°C 2) TsOH, DMP, t.a. + 56
Poichè il derivato del lattosio più utile per i nostri scopi, avendo la sola funzione OH-2’ deprotetta, è 55, dopo neutralizzazione del grezzo con NEt3, seguita da evaporazione
dell’eccesso di DMP e di MeOH e da rigoroso allontanamento dell’eccesso di NEt3 per
coevaporazione ripetuta con toluene, si procede ad una seconda acetonazione riprendendo semplicemente il residuo con DMP e lasciando agitare a temperatura ambiente. Dopo 3 ore si osserva (TLC) che il rapporto fra le due macchie corrispondenti a 55 e 56 risulta invertito, evidentemente grazie allo stabilirsi di una nuova posizione di equilibrio fra i due componenti, risultante dall’allontanamento del metanolo. Una flash-cromatografia porta ad ottenere i due poliacetonuri 55 e 56 puri, in resa rispettivamente del 65 e 22%, con proprietà chimico-fisiche e caratteristiche NMR corrispondenti a quanto riportato in letteratura.16
Di particolare interesse, è la possibilità di effettuare questa reazione su scala delle decine di grammi, ottenendo, quindi, in un solo passaggio dal lattosio, quantità di prodotto di partenza sufficiente per le sequenze successive.
3.2. - Trasformazione dell’unità β
β
β
β-
D-Galp in unità β
β
β-
β
D-ManNAc e β
β
β-
β
D-GlcNAc
Il tetracetonuro del lattosio 55 risulta un ottimo punto di partenza per le nostre sequenze sintetiche per due motivi: presenta un’unica funzione ossidrilica libera (OH-2΄) e le due tipologie di gruppi protettivi presenti sull’unità D-galatto sono ortogonali tra loro. Di fatti il
gruppo acetalico misto 2-metossiisopropilidenico (MIP) è molto più labile in ambiente acido rispetto ai gruppi isopropilidenici, tanto che può essere semplicemente idrolizzato in condizioni (MeOH-H2O e tracce di AcOH) in cui i tre acetali ciclici sono perfettamente
stabili, ma allo stesso tempo è sufficientemente stabile da permettere eventuali funzionalizzazioni (alchilazioni, acilazioni) o elaborazioni della posizione 2΄.16
3.2.1 Dall’unità βββ-β D-Galp all’unità ββββ-D-ManNAc
La via sintetica per trasformare un’unità D-Galp in unità D-ManNAc, prevede due processi distinti: amminazione con inversione in posizione 2 ed epimerizzazione della posizione 4. Schema 12 O Me2C O O OBn OGlc NHAc O Me2C O O OC(OMe)Me2 OGlc OH OGlc O O O O OC(OMe)Me2 OGlc O O O N OC(OMe)Me2 O H OGlc O O O N OH O H OGlc O O O N OBn BnO 57 58 61 55 Me2C 59 Me2C Me2C NMO, TPAP 4A, DCM NH2OH.HCl Na2CO3 MeOH 60 Me2C MeOH/H2O AcOH (tracce) 40°C BnBr/KOH 18-crwn-6 THF 1. LiAlH4/ Et2O 2. Ac2O/ MeOH
La possibilità di elaborare direttamente la posizione 2’ di 55 ha indotto ad affrontare per primo il processo di amminazione con inversione. Questa operazione era stata recentemente realizzata in maniera molto efficiente mediante una sequenza di ossidazione-ossimazione-riduzione con idruri, ottenendo, a conclusione del processo, il derivato disaccaridico a struttura β-D-talosamminica 61 (Schema 12).7
L’ossidazione di 55, a causa della labilità della funzione metossiisopropilica in 6΄, richiede l’uso di sistemi di reazione che operano in condizioni rigorosamente neutre come il sistema ossidante tetrapropilammonioperrutenato (nPrN4+RuO-4, TPAP) in presenza di
N-metilmorfolina-N-ossido (NMO), largamente utilizzato nel nostro laboratorio. Il TPAP è un reagente dotato di una buona chemoselettività: ossida rapidamente funzioni ossidriliche primarie in presenza di secondarie e la loro ossidazione porta alla formazione di aldeidi. Il TPAP è compatibile con numerosi gruppi funzionali reattivi come: epossidi, acetali e doppi legami e, inoltre, non causa racemizzazione dei centri stereogenici in posizione α al carbonile. Le quantità di TPAP che si usano in reazioni condotte in presenza di NMO, sono generalmente catalitiche, dato che l’NMO stesso, in eccesso nell’ambiente di reazione, ne rigenera le quantità consumate durante la reazione attraverso un meccanismo che non è stato ancora perfettamente chiarito.
L’ossidazione di 55 è effettuata a temperatura ambiente in soluzione di CH2Cl2 anidro
contenente 0.05 equivalenti di TPAP commerciale ed 1.5 equivalenti di NMO in condizioni anidre per la presenza di setacci molecolari 4Å polverizzati attivati, al fine di rimuovere l’acqua che si forma durante la reazione. In queste condizioni, dopo 4 ore a temperatura ambiente, si forma un unico prodotto a Rf maggiore che è isolato per semplice filtrazione
della miscela di reazione attraverso un triplice strato alternato di celite-gel di silice-celite ed evaporazione del solvente. L’analisi NMR (1H e 13C) del grezzo ottenuto come sciroppo evidenzia la presenza esclusiva di 57 (resa 98%) ed esso può essere direttamente utilizzato nella successiva reazione senza ulteriori processi di purificazione. Il chetone 57 presenta dati analitici e spettroscopici in accordo con quelli riportati in letteratura.17
La reazione di ossimazione dell’uloside 57, condotta in metanolo in presenza di Na2CO3
e NH2OH.HCl, costituisce un valido approccio sintetico in quanto permette di mantenere la
funzione acetalica mista (R’=MIP) al C-6΄, vista la basicità dell’ambiente di reazione. Quindi, una soluzione di 57 in MeOH è stata lasciata in agitazione a temperatura ambiente con un eccesso di Na2CO3 (2.3 eq.) e, dopo 30 minuti, è trattata con 2.3 eq. di NH2OH.HCl (Schema
12). Dopo 4 ore a riflusso l’analisi TLC evidenzia la completa scomparsa del prodotto di partenza e la formazione di un unico prodotto a Rf maggiore. Il consueto work-up della
reazione permette di ottenere un grezzo sciropposo costituito esclusivamente dallo stereoisomero idrossimminico (E)-58 come mostra l’analisi NMR. Il derivato (E)-58 presenta dati analitici e spettroscopici in accordo con quelli riportati in letteratura.7 In particolare la presenza del gruppo metossiisopropilico (MIP) in posizione 6’ di (E)-58 è facilmente confermata, negli spettri NMR dai segnali relativi al gruppo metossilico (1H: δ 3.15; 13C δ 48.9) e a quelli dei due metili [1H: δ 1.28, (s, 6H); 13C δ 24.8 e 24.7). L’avvenuta ossimazione è confermata nello spettro 13C dalla scomparsa del segnale attribuibile al carbonile (δ 197.3) sostituito da un segnale a δ 151.8 diagnostico per un doppio legame C=N-OH. In generale, è
anche possibile distinguere le forme diasteroisomeriche delle ossime, grazie al fatto che l’ossigeno del raggruppamento =N-OH esercita un forte effetto di deschermo sui protoni situati dalla stessa parte rispetto al doppio legame imminico: nel caso di 58, il doppio doppietto (J1’,3’ 0.7 Hz e J3’,4’ 7.9 Hz) attribuibile a H-3’ a δ 5.46, sensibilmente più
deschermato di tutti gli altri protoni piranosici, ne indica la configurazione (E).
Preparata l’ossima (E)-58, per ottenere 61 è necessario effettuare una riduzione stereoselettiva del legame C=N; a tal proposito, nel laboratorio dove è stata svolta questa tesi, sono stati effettuati diversi studi che prevedono l’utilizzo di idruri come il LiAlH4.7 I dati
sperimentali hanno dimostrato che tali reazioni prevedono l’attacco dell’idruro su substrati tipo 62, analoghi a 58, sulla faccia del doppio legame C=N, favorendo l’esclusiva formazione del gruppo amminico a configurazione D-talo (Figura 15).
Figura 15
Tale stereoselettività è da attribuire sia all’effetto sterico di schermo esercitato dal ponte isopropilidenico e sia da uno “stereocontrollo anomerico” che dirigono l’attacco dell’idruro dalla faccia opposta a quella del sostituente anomerico stesso, con formazione esclusiva o con alta stereoselettività dell’ammina a configurazione 1,2-cis.
È stato inoltre rilevato che la stereoselettività delle reazioni di riduzione delle ossime con LiAlH4 non dipende dalla loro isomeria geometrica (E e/o Z) e che, pur mostrando una
forte prevalenza per la formazione del derivato D-talosamminico, la formazione dell’epimero
al C-2΄ della serie D-galatto è dipendente dal tipo di sostituente al C-6΄ ed all’ossigeno
ossiminico. Più recentemente è stato inoltre dimostrato che è possibile ottenere una totale stereoselettività proteggendo le ossime analoghe a 62, in C-2΄ e C-6΄, con gruppi benzilici.7
Seguendo queste indicazioni, la via sintetica ha previsto dapprima la deprotezione della posizione OH-6’ attraverso un’idrolisi selettiva del gruppo metossiisopropilico per riscaldamento (40°C) dell’ossima (E)-58 grezza in soluzione metanolica acquosa (MeOH/H2O 10:1) e tracce di AcOH glaciale. Dopo 4 ore, l’eliminazione dei solventi
mediante coevaporazione con toluene permette di ottenere un solido schiumoso costituito esclusivamente (1H e 13C NMR) da (E)-59 (resa 92% calcolata da 55) che è direttamente utilizzato nella successiva reazione di benzilazione senza ulteriori processi di purificazione. Il derivato (E)-59 presenta dati analitici e spettroscopici in accordo con quelli riportati in
O O O OR OX NOR H 62
letteratura.7 La presenza di un gruppo alcolico primario in posizione 6΄ di (E)-59 è confermata, negli spettri NMR, dall’assenza dei segnali diagnostici relativi al gruppo metossiisopropilico.
L’ossima (E)-59 grezza è stata quindi sottoposta a benzilazione secondo un protocollo ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio, che si basa sulla salificazione delle funzionalità ossidriliche mediante il sistema KOH/18-corona-6 in THF umido, seguita dal trattamento con bromuro di benzile. La KOH in presenza dell’etere corona forma una coppia ionica costituita dal sistema chelato etere-K+ e dall’OH- (Figura 16) nel quale l’anione ossidrile acquisisce una basicità maggiore. La sostituzione del K+, che con OH- fornisce una coppia ionica molto stretta, con una struttura molto più grande quale il chelato etere-K+, esalta la reattività dell’anione OH- rendendolo capace di salificare le funzionalità ossidriliche che sono quindi in grado di reagire con l'elettrofilo presente in soluzione.
Figura 16 O O O O O O K O O O O O O 18-corona-6 KOH OH +
-Sottoponendo (E)-59 grezzo a benzilazione secondo questa metodologia con un eccesso di bromuro di benzile (4 equivalenti), dopo 4 ore l’analisi TLC evidenzia la scomparsa del prodotto di partenza e la formazione di un unico prodotto a Rf maggiore. Dopo trattamento
della miscela di reazione e flash cromatografia su gel di silice, si isola il di-O-benzil derivato (E)-60 con una resa complessiva del 77% calcolata a partire da 55. L’ossima (E)-60 presenta dati analitici e spettroscopici in accordo con quelli riportati in letteratura.7 La presenza di due gruppi benzilici è confermata, nello spettro protonico, da un multipletto a δ 7.38-7.26, integrante per 10 protoni, e da due sistemi AB (δ 5.12 e 5.02, JA,B 12.7 Hz; δ 4.49 e 4.56, JA,B
11.9 Hz) integranti ciascuno per due protoni ed attribuibili ai due metileni benzilici. Anche lo spettro 13C di (E)-60 conferma la struttura proposta e presenta, oltre a tutti gli altri segnali della molecola, quattro segnali a δ 73.4, 76.8, 137.9 e 137.0, attribuibili rispettivamente ai due CH2 benzilici ed ai due carboni quaternari aromatici. Inoltre il segnale relativo al C-6´ (δ
68.8) di (E)-60 risulta deschermato di circa 7 ppm rispetto al corrispondente segnale di (E)-59 (δ 61.8) per la presenza del gruppo etereo in tale posizione.
Si procede quindi trattando l'ossima (E)-60, con un eccesso di LiAlH4 in Et2O anidro
(Schema 12) e, dopo 72 ore a riflusso, l'analisi TLC ha evidenziato la completa scomparsa del prodotto di partenza. Il grezzo di reazione isolato dopo i necessari trattamenti non è né purificato né caratterizzato per NMR ma è sottoposto direttamente ad N-acetilazione per
trattamento con Ac2O in metanolo. Una purificazione per flash cromatografia su gel di silice
del grezzo ottenuto, ha permesso di isolare il derivato N-acetilamminico 61 a configurazione
D-talo in resa dell’82% che presenta dati analitici e spettroscopici in accordo con quelli
riportati in letteratura.18 In particolare nello spettro protonico di 61 la presenza del gruppo acetammidico è confermata da un doppietto (J2´,NH 9.0 Hz), scambiabile con D2O, e da un
singoletto (δ 1.88), integrante per tre protoni, assegnabili rispettivamente al gruppo NH e al metile acetilico. L’avvenuta inversione al C-2´ è evidenziata dal basso valore della costante di accoppiamento J1’,2’ 2.5 Hz che indica una disposizione equatoriale del protone H-2΄, propria
della configurazione D-talo. Inoltre nello spettro 13C il valore di chemical shift della risonanza del C-2' (δ 48.6) risulta più schermato (circa 8 ppm) per la presenza del gruppo NHCOMe in tale posizione.
Una volta arrivati a disporre del derivato β-D-talosaminico 61 abbiamo affrontato la sua
trasformazione in derivati β-D-mannosaminici attraverso inversione di configurazione in
posizione 4’. Un procedimento di epimerizzazione al C-4 di derivati D-talopiranosidici, sia
neutri che amminati, è stato recentemente sviluppato nel nostro Laboratorio19 ed ha costituito una metodica di tipo generale per accedere, partendo da β-D-galattopiranosidi, a β-D
-mannosidi e β-D-mannosammine, difficilmente accessibili per glicosidazione diretta. Il
metodo si basa su una semplice sequenza (Schema 13) basata sulla disidratazione regioselettiva di un intermedio β-D-talopiranosidico (63), ottenuta per formazione di un
intermedio 4-O-imidazilsolfonato non isolato che, spontaneamente, evolve via una eliminazione regioselettiva coinvolgente H-3, a dare enol eteri es-3-enopiranosidici (64), la cui idroborazione-ossidazione fornisce, grazie alla presenza del sostituente assiale al C-2, una reazione completamente stereoselettiva con attacco del borano dalla faccia α e formazione di prodotti a configurazione β-D-manno (65).
Schema 13 PO OH O OP OR X PO O H O OP OR X OR O X PO PO 65 1. BMS 2. H2O2/NaOH 63 Im2SO2/NaH DMF 64 X = OP oppure NHAc
La disponibilità di un derivato N-acetil-talosaminco protetto in 3,4 con un acetale isopropilidencio, però, ha fatto prendere in considerazione una procedura di epimerizzazione al C-4 differente, basata sulla formazione di intermedi enol eterei tipo 66 (Figura 17), isomeri di 64, aventi il doppio legame in 4,5 dai quali, per idroborazione-ossidazione, è ragionevole
pensare di ottenere rispettivamente un attacco del borano al C-4, per ragioni elettroniche e stereoselettive dalla faccia α, a causa della presenza del sostituente assiale al C-2.
Figura 17 O X PO OP OR 66: X = OP oppure NHAc
L’idea è stata quella di applicare al derivato intermedio N-acetil-talosaminico 61, la stessa reazione di eliminazione basica di acetone, nota per derivati β-D-galattopiranosidici20
sperando di ottenere in maniera efficiente un es-4-eno derivato, tipo 66, su cui effettuare, dopo protezione del gruppo OH allilico in 3, la reazione di idroborazione-ossidazione.
Schema 14 O O Me2C O NHAc OBn OGlc O NHAc O H OBn OGlc O NHAc OBn OGlc BnO O O H NHAc OBn OGlc BnO t-BuOK THF, 80°C BnBr, KOH 1) BMS/THF 2) H2O2, NaOH 68 69 70 61
La reazione di eliminazione di acetone da derivati 3,4-O-isopropilidene-β-D
-galattopiranosidici risulta molto efficace data la sua regioselettività, dovuta ad un’estrazione selettiva del protone assiale in C-5΄, provocata, oltre che dal rilascio di tensione anulare della fusione diossolanica in 3΄,4΄, anche all’assetto trans fra il protone in C-5΄ e il gruppo uscente in C-4΄, orientamento decisivo per reazioni di eliminazione che avvengono con meccanismi di tipo E2, come riportato nello Schema 15.
Schema 15 O H O O X OP OR O X O H OP OR t-ButO
-X: equatoriale = serie galatto; assiale = serie talo
Il trattamento di 61 con t-BuOK in THF, lasciando evolvere la reazione sotto agitazione magnetica a 80°C a riflusso del solvente, porta ad una rapida e selettiva formazione dell’enol etere 68. Dopo 20 minuti, infatti, l’analisi TLC mostra la presenza in tracce del prodotto di partenza, la comparsa di minime quantità di un sottoprodotto e di un prodotto largamente
maggioritario. La soluzione quindi viene raffreddata, trattata con NaHCO3 e estratta con
CH2Cl2 e la fase organica così ottenuta viene concentrata a pressione ridotta, dando luogo ad
uno sciroppo grezzo che, all’analisi NMR, mostra i segnali attesi per l’enol etere 68 (Schema 14). Il grezzo di reazione è sottoposto, senza ulteriori purificazioni, alla reazione di benzilazione con BnBr, 18-crown-6 e KOH, condizioni che evitano l’eventuale reazione parassita di N-benzilazione (Schema 14). Si ottiene così l’enol etere es-4-enopiranosidico completamente protetto 69, in resa eccellente (91% a partire da 61). Il derivato 69 è stato completamente caratterizzati dal punto di vista chimico fisico e i dati NMR ricavati utilizzando tecniche mono-dimensionali (1H e 13C) e bidimensionali (DEPT, COSY, HECTOR), sono in accordo con la struttura proposta (vedi parte sperimentale). La formazione del doppio legame in C-4΄,C-5΄, è dimostrabile oltre che dalla scomparsa del picco relativo al protone H-5΄ dallo spostamento a ppm più alti del segnale di H-4΄ (δ 5.04), in quanto protone olefinico, anche dall’analisi del 13C NMR dove i segnali relativi a C-4΄ e C-5΄ a causa del loro coinvolgimento nel doppio legame si trovano a ppm molto più alti (rispettivamente δ 99.4 e 150.7 ppm).
E’ da notare che la reazione di eliminazione di 61 è molto più efficace di quella riportata su analoghi derivati del lattosio, ove si osservano sottoprodotti derivanti da eliminazione di acetone anche sulla porzione gluco. Probabilmente, in questo caso la sfavorevole interazione fra il sostituente assiale al C-2’ ed il ponte isopropilidenico 3’,4’ costituisce un ulteriore fattore favorevole che, aumentando la tensione dovuta alla presenza del ponte isopropilidenico, ne favorisce l’eliminazione, rendendola molto più rapida e selettiva rispetto alle concorrenti reazioni di eliminazione di acetone sulle altre funzioni isopropilideniche.
La reazione di idroborazione-ossidazione di 69 comporta il trattamento con una soluzione 1:10 (v/v) di BH3•Me2S in THF. Il borano viene aggiunto ad una soluzione in THF
dell’enol etere per gocciolamento ad una temperatura di 0°C. Dopo 30 minuti a freddo, l’analisi TLC evidenzia la formazione di piccole quantità di un prodotto a Rf molto basso. Proseguendo la reazione a temperatura ambiente, il prodotto di partenza risulta completamente scomparso dopo 4 ore. Si alcalinizza, quindi la soluzione gocciolando a 0°C in successione H2O, NaOH 10% e H2O2 al 35% e, dopo 2 ore di agitazione, si ripartisce fra
H2O e solvente organico, per ottenere alla fine del trattamento e purificazione cromatografica,
il derivato D-mannosamminico 70, in resa dell’80%. Per analisi 1H e 13C NMR è stato poi possibile confermare l’esito positivo della reazione secondo la regio- e stereo-selettività prevista e desiderata. Di fatti, nello spettro protonico sono state individuate le costanti
d’accoppiamento di H-4΄ (J3΄,4΄ 9.6 e J4΄,5΄ 9.6 per 70) i cui alti valori stanno ad indicare la sua
disposizione assiale, dimostrando la riuscita inversione di configurazione al C-4’.
Valutando il processo complessivo che, a partire dal derivato del lattosio 55, ha portato al disaccaride protetto β-D-ManNAc-(1→4)-D-Glc (70) passando attraverso l’intermedio β-D -TalNAc-(1→4)-D-Glc (61), occorre sottolineare come il cambiamento del processo di
epimerizzazione, da quello precedentemente descritto basato sulla formazione di es-3-enopiranosidi,19 a quello ora proposto, abbia notevolmente migliorato l’efficienza del processo, diminuendo la lunghezza della sequenza e, sopratutto, incrementando la resa del passaggio di idroborazione-ossidazione.
3.2.2 Dall’unità βββ-β D-Galp all’unità ββββ-D-GlcNAc
La trasformazione del nucleo β-D-galattopiranosidico in nucleo β-D -glucomannosamminico richiede anch’essa l’elaborazione delle posizioni C-2 e C-4. In particolare, sul C-4’ è necessaria una reazione di epimerizzazione (da OH-4 assiale a OH-4 equatoriale), mentre la seconda richiede un’amminazione al C-2 con formale ritenzione di configurazione (da OH-2 equatoriale a NHAc-2 equatoriale). Questa seconda operazione è stata recentemente effettuata in maniera molto efficiente attraverso due consecutive reazioni di configurazione, che hanno portato alla trasformazione del nucleo β-D-galattopiranosidico in
unità β-D-glucosamminica, passando da un intermedio β-D-talopiranosidico.21
L’efficienza che è stata riscontrata nel processo di epimerizzazione al C-4’ via intermedio es-4-enopiranosidico (Schema 14), ha indicato, tuttavia, come la via migliore per realizzare il processo complessivo sia quella in cui le trasformazioni vengono condotte secondo il seguente ordine: a) epimerizzazione al C-2’ e formazione di un intermedio 3,4-O-isopropilidene-β-D-talopiranosidico completamente protetto; b) epimerizzazione al C-4’ via intermedio es-4-enopiranosidico ottenendo un disaccaride β-D-mannopiranosidico; c)
amminazione con inversione al C-2’ mediante SN2 con un nucleofilo azotato su un intermedio
solfonato.
Per completare le due prime operazioni ed arrivare, quindi, a disporre di un derivato
β-D-mannopiranosidico, si è proceduto come illustrato nello Schema 16, partendo dall’uloside 57 grezzo, che, sottoposto ad una riduzione con idruri, fornisce in alta resa chimica e completa stereoselettività il derivato β-D-talopiranosidico 71.17 Trattando, quindi, il composto 57 con NaBH4 in MeOH, dopo 2 ore per analisi TLC viene evidenziata la scomparsa del
reazione a consueto trattamento si ottiene un grezzo di consistenza sciropposa che per cromatografia su colonna di gel di silice fornisce 71 con resa eccellente del 96% (calcolata a partire da 55). L’analisi spettroscopica (1H e 13C) conferma, in accordo con quanto riportato in letteratura,17 la configurazione D-talo del composto 71.
Prima di effettuare l’eliminazione di acetone, è necessario che il C-2’sia protetto e che il gruppo acetalico misto al C-6’sia sostituito con un gruppo stabile alle condizioni fortemente basiche di eliminazione. Inoltre, il gruppo al C-2’ dovrà essere selettivamente deproteggibile, in modo da potere elaborare questa posizione con la successiva operazione di amminazione con inversione. Come gruppi protettivi stabili nelle reazioni progettate e ortogonali fra loro, è stata scelta una combinazione del gruppo benzilico e di quello p-metossibenzilico (PMB). Schema 16 O O Me2C O OH OGlc OC(OMe)Me OGlc O O O O OC(OMe)Me2 O O Me2C O OPMB OGlc OH O O Me2C O OPMB OGlc OBn O OPMB O H OBn OGlc O OPMB OBn OGlc BnO O O H OPMB OGlc OBn BnO NaBH4 71 57 Me2C 72 76 MeOH 1. PMBBr, NaH/DMF 2. 5%aq. HCl/ H2O-DCM BnBr NaH/DMF 74 75 73 t-BuOK THF BnBr NaH/DMF 1) BMS/THF 2) H2O2, NaOH
Si procede quindi con la p-metossibenzilazione sul C-2΄ trattando l’alcol 71, in presenza di un eccesso di NaH, con p-metossibenzilcloruro, rilevando dopo due ore (TLC) la formazione di un unico prodotto. Eliminato poi l’eccesso di NaH e eliminati i solventi per evaporazione a pressione ridotta, il grezzo ottenuto, in soluzione di diclorometano, viene trattato con HCl acquoso al 5% (v/v) allo scopo di rimuovere selettivamente la funzione metossiisopropilica in posizione 6’. Per estrazione e evaporazione dei solventi, si ottiene un grezzo di reazione la cui analisi NMR (1H e 13C) determina la presenza esclusiva dell’alcol 72. Il grezzo ottenuto viene direttamente sottoposto a benzilazione classica (BnBr, NaH in DMF) e, dopo consueto work-up, la miscela di reazione viene sottoposta a flash cromatografia su colonna di gel di silice. Il derivato talopiranosidico 73 viene in questo modo isolato con una resa dell’83%, calcolata da 71.
Dall’analisi NMR la presenza di due gruppi benzilici è confermata, nello spettro protonico dalla presenza di multipletti nella zona compresa tra δ 6.82-7.36, integranti per 9 protoni, relativi ai protoni aromatici sia del benzile in 6΄ che il gruppo del PMB in 2΄. La conferma
inoltre della presenza di quest’ultimo sostituente si ottiene sia attraverso l’analisi dello spettro protonico, dove a 3.76 ppm possiamo ritrovare un singoletto relativo al gruppo –OMe aromatico, che risuona a valori più alti in quanto più deschermato rispetto agli altri metossili sul C-1, che dall’analisi del 13C NMR, dove ritroviamo due carboni quaternari (δ 131.7 e 160.0) e il segnale del carbonio metossilico (δ 55.8) attribuibili al gruppo PMB. Inoltre la perdita dei segnali relativi al gruppo MIP e il valore del chemical shift del segnale relativo al C-6΄ (δ 70.6), più deschermato (circa 10 ppm) rispetto al corrispondente segnale di 71 dimostra l’avvenuta rimozione del gruppo MIP e la successiva formazione dell’etere benzilico in posizione 6’.
Una volta avuto a disposizione il β-D-talopiranoside 73, la sua epimerizzazione al C-4 è stata realizzata con metodica identica a quella già descritta per ottenere la β-D-mannosammina
70 dalla β-D-talosammina 61 (Schema 14, pag. 26).
L’eliminazione di acetone viene effettuata, anche in questo caso, per trattamento con t-BuOK in THF a caldo (80°C), ottenendo, dopo soli 20 minuti, l’enol etere 74 come prodotto praticamente esclusivo della reazione il quale, direttamene benzilato con BnBr ed NaH in DMF, porta in buona resa (77%) all’enol etere protetto 75. La presenza di due gruppi benzilici è confermata, nello spettro protonico, da un multipletto a δ 7.38-7.25, integrante per 10 protoni, da 2 sistema AB (δ 4.78 e 4.66, JA,B 11.1 Hz; 4.53 e 4.45, JA,B 11.8 Hz;) integranti
ciascuno per due protoni ed attribuibili ai due metileni benzilici. Inoltre la presenza del doppio legame è confermata, nello spettro protonico dall’assenza del segnale attribuibile al protone H-5’ e dalla presenza di un doppietto attribuito al protone H-4’ che risulta deschermato (δ 4.91) perché olefinico e, nello spettro 13C, da due segnali a δ 1003.5 e 150.5 attribuibili ai due carboni olefinici (rispettivamente al C-4’ e C-5’).
Sottoponendo l’enol etere 75 a reazione di idroborazione con BMS in THF seguita da ossidazione con NaOH e H2O2 si ottiene l’atteso derivato β-D-mannopiranosidico 76, la cui
struttura è confermata dall’analisi NMR (vedi parte sperimentale).
Per realizzare l’ultima sequenza di amminazione con inversione al C-2’ è necessario effettuare una reazione SN2 con un nucleofilo azotato su un solfonato, secondo quanto
illustrato nello Schema 17. A tal scopo occorre proteggere mediante benzilazione (BnBr, NaH in DMF), l’unica funzione ossidrilica libera (OH-4’) di 76. Il grezzo ottenuto per trattamento della miscela di reazione e evaporazione a pressione ridotta dei solventi, sottoposto a purificazione flash cromatografica su gel di silice, permette di isolare il composto 77 in resa del 93%.
Schema 17 O O H OBn OGlc OPMB BnO O OBn N3 OGlc BnO BnO O OBn OPMB BnO OGlc BnO O OBn OH BnO OGlc BnO O OBn OSO2Im BnO OGlc BnO 76 77 78 79 80 BnBr, NaH DMF DDQ DCM/H2O Im2SO2,NaH DMF NaN3,DMF
I dati spettroscopici ottenuti dall’analisi NMR (1H e 13C) di 77 confermano la riuscita della reazione, in quanto i valori degli integrali dei multipletti (1H, NMR) nella zona dei protoni aromatici indicano, oltre alla presenza del gruppo PMB, la presenza di tre sostituenti benzilici; inoltre, nello spettro 13C, il segnale relativo al C-4΄ (δ 75.4) di 77 risulta deschermato di circa 8 ppm rispetto al corrispondente segnale (δ 67.5) di 76 a conferma dell’avvenuta eterificazione in questa posizione. La configurazione D-manno di 77 è
confermata, nello spettro protonico, dalla presenza di un doppio doppietto attribuito al protone H-4’ che presenta valori elevati di entrambe le costanti di accoppiamento (J3΄,4΄ 9.4 Hz J4΄,5 9.6
Hz) indicative di un assetto assiale-assiale-assiale dei protoni H-5’, H-4’ e H-3’.
A questo punto è possibile condurre una deprotezione selettiva della funzione ossidrilica in C-2΄, per mezzo di un agente ossidante come il 2,3-dicloro-5,6-diciano-benzochinone (DDQ). Tale reazione prevede inizialmente la formazione di un “complesso a trasferimento di cariche” tra il DDQ accettore) e l’anello aromatico del gruppo PMB (elettron-donatore), seguito da una deidrogenazione benzilica. Nello Schema 18 è illustrato il meccanismo di reazione proposto.22
Schema 18 OMe ROCH2 O O Cl Cl CN CN OMe ROCH O H OMe RO OMe H O Cl OH OH Cl CN CN CT-complex H2O ROH DDQH + + + +
Una possibile complicazione dell’uso del DDQ per la rimozione del gruppo p-metossibenzilico, potrebbe derivare dalla formazione della specie ridotta (2,3-dicloro-5,6-diciano-diidrochinone, DDQH) che, presentando un’apprezzabile acidità, potrebbe causare l’idrolisi dei gruppi isopropilidenici acido-labili presenti sulla porzione riducente. Per ovviare a questo problema, si può lavorare in solventi come DCM e H2O in cui il DDQH è insolubile.
In questo modo, con l’evolvere della reazione, il DDQH che si forma precipita, lasciando inalterato il pH dell’ambiente di reazione. Tenendo sotto stretto controllo l’evolversi della reazione e utilizzando 1.5 equivalenti di DDQ, è possibile ottenere in tempi brevi una deprotezione selettiva dell’OH-2΄, senza rischiare la reazione parassita di deprotezione dei gruppi isopropilidenici.
L’intermedio 77 viene quindi solubilizzato in una soluzione di CH2Cl2-H2O 18:1 (v/v) e
addizionato di 1.5 equivalenti di DDQ. Si lascia la miscela in agitazione a temperatura ambiente, monitorando l’evolvere della reazione per analisi TLC. Dopo un’ora si evidenzia, oltre a tracce di prodotto di partenza, una macchia nettamente prevalente e la comparsa di una macchia a Rf più basso. Si arresta la reazione per trattamento con una soluzione satura di
NaHCO3 e, dopo estrazione della fase acquosa ed evaporazione della fase organica, si ottiene
un grezzo che dopo purificazione flash cromatografica fornisce il composto 78 in resa del 76%.
L’alcol 78 è stato completamente caratterizzato dal punto di vista chimico fisico e i dati NMR sono in accordo con la struttura proposta (vedi parte sperimentale). In particolare il confronto con gli spettri del precursore 77 permette di verificare l’esito della reazione, in quanto, oltre alla scomparsa del segnale relativo al gruppo OMe benzilico, viene meno il forte effetto schermante dato dalla presenza dell’anello aromatico sul C-2΄, che nel composto 78 risuona a 68.7 ppm, contro i 75.8 ppm dello stesso in 77.
Il precursore 78 rappresenta un ottimo punto di partenza per la realizzazione dell’amminazione con inversione di configurazione in posizione 2΄ attraverso la più classica trasformazione di una funzione alcolica in amminica mediante reazioni di sostituzione di solfonati con nucleofili azotati (Schema 17). La preparazione dell’intermedio imidazilsolfonato 79 è realizzata per trattamento di 78 con NaH e Im2SO2 a -30°C. Quando
l’analisi TLC (1 ora) mostra la formazione di un unico prodotto, si distrugge l’eccesso di NaH per aggiunta di MeOH a -40°C. Dopo estrazione del prodotto, evaporazione dei solventi e purificazione flash cromatografica del grezzo, si ottiene l’imidazilsolfonato 79 in resa dell’83%. L’analisi spettroscopica (1H e 13C NMR) evidenzia i segnali relativi alla struttura imidazolica (vedi parte sperimentale), mentre il forte effetto di deschermo (15-16 ppm) che si
evidenzia sul C-2΄ (da δ 68.7 a δ 84.6) conferma l’avvenuta solfonazione del gruppo alcolico OH-2’.
Il trattamento del composto 79, avente un buon gruppo uscente sul C-2’, con NaN3 a
100°C in DMF, porta, attraverso una sostituzione di tipo SN2, all’azide 80, precursore diretto
dell’unità β-D-GlcNAc. La reazione di inversione è particolarmente efficiente e permette di isolare, dopo flash cromatografia, 80 in resa del 92%, dimostrando ancora una volta l’utilità del gruppo imidazilato nell’elaborazione dei gruppi alcolici dei carboidrati. L’azide 80 è stata caratterizzata spettroscopicamente e l’analisi degli spettri (1H e 13C), evidenzia, oltre alla perdita del gruppo sulfonilimidazolico, l’avvenuta inversione di configurazione in posizione 2’, come evidenziato dal confronto delle costanti di accoppiamento vicinali fra i protoni H-1’, H-2’ e H-3’ di 79 e 80 (Tabella 1).
Tabella 1
Composto J1΄,2΄ (Hz) J2΄,3΄ (Hz) J3΄.4΄ (Hz)
79 0.6 2.3 10.5
80 7.8 9.1 8.6
Il gruppo azidico è, in generale, facilmente trasformabile in gruppo acetammidico utilizzando diverse metodiche basate, in ogni caso, sulla riduzione ad ammina seguita direttamente da N-acetilazione con anidride acetica in MeOH. Per questo si è ritenuto di considerare 80 come il prodotto disaccaridico da cui partire per i passaggi successivi di trasformazione dell’unità riducente di D-Glc in DNJ, rimandando la trasformazione del
gruppo azidico in NHAc alla fase finale della sintesi.
3.3.-Preparazione di derivati β
β
β
β-
D-esosaminil-(1
→4)-
D-xilo-esos-5-ulosici
Effettuata l’opportuna funzionalizzazione della porzione galattopiranosidica del lattosio (39), si procede all’elaborazione dell’unità di D-glucosio protetta, in modo da preparare gli
intermedi chiave 1,5-dicarbonilici 83 e 84 (Schema 19), su cui effettuare, con l’ultimo processo della sintesi, la reazione di doppia amminazione riducente intramolecolare (amminociclizzazione).
Schema 19 OH O O OH O O X Y OBn RO BnO OHC O O O OH O O X Y (MeO)2CH OBn RO BnO O O O O O O X Y RO OBn (MeO)2CH BnO 70: X= NHAc;Y= H;R=H; 80: X= H;Y= N3;R=Bn; 81: X= NHAc;Y= H;R=H; 82: X= H;Y= N3;R=Bn; 83: X= NHAc;Y= H;R=H; 84: X= H;Y= N3;R=Bn;
3.3.1. - Deprotezione selettiva del gruppo 5,6-O-isopropilidenico di 70 e 80
Il primo stadio della sequenza sintetica ha previsto la rimozione del ponte diossolanico sul C-5 e C-6 attraverso un’idrolisi acida controllata. E’ da sottolineare che la presenza di diverse funzioni acido-labili su questi intermedi rende indispensabile la ricerca delle condizioni di idrolisi atte a mantenere il legame interglicosidico, il gruppo acetalico 2,3-O-isopropilidenico e quello dimetilacetalico che protegge il carbonile anomerico, la cui deprotezione porterebbe alla ripiranilizzazione dell’unità riducente in forma piranosica, impegnando l’OH-5 nel legame semiacetalico, impedendone, di conseguenza, la possibilità di ossidazione selettiva.
Studi precedenti di idrolisi con soluzione acquose di AcOH di derivati poliacetonati del lattosio, tipo 85 (Figura 18),23 hanno evidenziato una forte differenza di reattività fra i diversi gruppi acido-labili, evidenziando che quelli più reattivi sono i due acetonuri in 3’,4’, coinvolgente una fusione trans-diossolanica tensionata, e in 5,6, che impegna un gruppo alcolico primario. Sensibilmente meno reattivi sono il gruppo 2,3-O-isopropilidenico, che impegna una funzione diolica secondaria aciclica, ed il gruppo dimetilacetalico, mentre il legame interglicosidico è privo di reattività in AcOH acquoso.
Figura 18 O O O (MeO)2CH O O O O O OBn OBn 85
Negli acetonuri 70 e 80 è presente una sola delle due funzioni diosssolaniche più reattive, riducendo la problematica relativa alla competizione fra i due gruppi più reattivi
verso l’idrolisi. E’, quindi, sufficiente un’accurata valutazione dell’evoluzione della reazione per analisi TLC per stabilire il tempo ottimale a cui arrestare la reazione.
Nelle condizioni utilizzate per i composti 70 e 80 (AcOH all’80%, 40 °C), dopo 4 ore l’analisi TLC mostra, oltre a tracce del prodotto di partenza, la presenza di un prodotto largamente maggioritario e tracce di composti a Rf minore, probabilmente relative al tetraolo e al
composto completamente deprotetto. La rimozione azeotropica dell’acido acetico con toluene e la successiva purificazione flash cromatografica porta al triolo 86 e al diolo 87 (Schema 20) con rese, rispettivamente, dell’80% e del 74%.
Schema 20 O O O (MeO)2CH O O X OBn RO BnO Y O O O OH (MeO)2CH O O X OBn RO BnO Y OH 70: X= NHAc;Y= H;R=H; 80: X= H;Y= N3;R=Bn; 86: X= NHAc;Y= H;R=H; 87: X= H;Y= N3;R=Bn; AcOH 80%, 40°C
L’analisi spettroscopica (1H e 13C NMR) effettuata su 86 e 87, composti finora non riportati in letteratura, risulta essere in perfetto accordo con le strutture proposte. In particolare gli spettri protonici di 86 e 87 consentono un facile controllo della presenza dei gruppi dimetilacetalici e degli acetali isopropilidenici, dato che i segnali relativi ai C-metili ed ai metossili sono facilmente individuabili per la loro intensità e localizzazione in zone degli spettri poco affollate: quelli relativi ai metossili a δ 3.0-3.5 e quelli relativi a C-metilici degli anelli diossolanici a δ 1.3-1.5. Il paragone dei valori di chemical shift dei carboni C-5 e C-6 negli spettri 13C dei composti deprotetti 86 e 87 con quelli dei corrispondenti carboni dei derivati protetti 70 e 80 (Tabella 2) permette di verificare l’avvenuta rimozione del gruppo isopropilidenico in posizione 5,6. La presenza dei gruppi acetalici in queste posizioni esercita, infatti, un effetto di deschermo di circa 2-5 ppm rispetto ai corrispondenti segnali dei carboni non funzionalizzati.
Tabella 2.
70 86 80 87
C-5 76.1 73.0 78.0 73.0
3.3.2. - Ossidazione regioselettiva al C-5 dei polioli 86 e 87
Il successivo passo ha previsto l’ossidazione regioselettiva dell’ossidrile al C-5 di 86 e 87. Anche in questo caso è stato necessario cercare una metodica di ossidazione che operi in condizioni blande compatibili con i gruppi acido labili presenti sui dioli 86 e 87, come la funzione isopropilidenica sul C-2 e C-3, dimetilacetalica sul C-1 e glicosidica. Un efficace metodo di ossidazione regioselettiva di carboidrati ed altri polioli prevede la formazione di intermedi ciclici stannilidenici di formula generale 88 (Figura 19), seguita da apertura ossidativa dell’acetale stannilidenico con Br2 o NBS, reagenti in grado generare un bromo
elettrofilo (Br+).24 Figura 19 OH OH (C) O O (C) SnBu2 n Bu2SnO n H2O 88 + +
Gli acetali stannilidenici di tipo 88 sono generalmente ottenuti per trattamento di un 1,2- o 1,3-diolo con un equivalente di Bu2SnO in toluene ed in condizioni di rimozione
azeotropica dell’acqua che si forma durante la reazione. In genere questi derivati sono stabili, la loro manipolazione non richiede particolari precauzioni (atmosfera inerte, ambienti rigorosamente anidri) e sono ottenuti in maniera quantitativa e quindi non richiedono processi di purificazione. Essi reagiscono con vari tipi di elettrofili in solventi a bassa polarità (toluene, cloroformio) e la reazione risulta essere, nella maggior parte dei casi, completamente regioselettiva. Si pensa che una spiegazione plausibile dell’andamento della reazione sia da ricercarsi nella differenza di coordinazione che si realizza, per ragioni di ingombro sterico, nelle strutture oligomeriche per i differenti atomi di ossigeno e nelle sottili differenze di acidità e di elettronegatività delle diverse funzioni alcoliche.
Il meccanismo di apertura ossidativa dell’acetale stannilidenico è illustrato nella Figura 19. L’attacco del reagente (Br2 o NBS) sui derivati stannilidenici avviene sull’ossigeno
anulare più impedito promuovendo il trasferimento di idruro secondo un meccanismo ciclico e concertato dal derivato stannilidenico al bromo, con formazione di HBr e dell’intermedio chetonico 88a (Figura 20) in cui il gruppo stannossanico, a forte richiesta sterica, rimane legato sempre nella posizione meno ingombrata (C-6) determinando l’ossidazione regioselettiva dell’ossidrile secondario OH-5.
Figura 20 Br Br Sn O H O Bu Bu O Sn Br O Bu Bu OH O HBr 88a SnBu2Br2 +
Sulla base di queste considerazioni i composti 86 e 87 (Schema 21) sono stati sottoposti a reazione di stannlidenazione con quantità equimolari di Bu2SnO in toluene ed in condizioni di
rimozione azeotropica dell’acqua mediante apparecchiatura Dean-Stark. Dopo 20 ore a riflusso del solvente (140°C), si concentra la soluzione ed il derivato stannilidenico, ripreso con CHCl3, è trattato a 0°C e in assenza di luce con quantità equimolari di NBS. Dopo
l’aggiunta si lascia evolvere la reazione a temperatura ambiente, fino a che l’analisi TLC (1 ora) evidenzia la scomparsa di 86 e 87 e la formazione di un prodotto maggioritario a Rf più
alto per entrambe le reazioni. La successiva purificazione flash cromatografica su gel di silice dei grezzi di reazione ha fornito i 5-cheto derivati 81 e 82 in resa rispettivamente del 94% e 77% (Schema 21). Schema 21 O O OH (MeO)2CH O O X OBn RO BnO Y OH O O OH (MeO)2CH O O X OBn RO BnO Y O OH OH OH O O X OBn RO BnO Y O OHC 86: X= NHAc;Y= H;R=H; 87: X= H;Y= N3;R=Bn; 1) Bu2SnO, Toluene 81: X= NHAc;Y= H;R=H; 82: X= H;Y= N3;R=Bn; 2)NBS,CHCl3 CF3COOH, 90% 83: X= NHAc;Y= H;R=H; 84: X= H;Y= N3;R=Bn;
Gli ulosidi 81 e 82, non riportati in letteratura, sono stati completamente caratterizzati dal punto di vista chimico-fisico e i dati NMR sono in accordo con le strutture proposte (vedi parte sperimentale). L’avvenuta ossidazione è confermata nei rispettivi spettri 13C NMR dai segnali, rispettivamente a δ 210.9 e 211.2, diagnostici per le funzioni chetoniche e dalla scomparsa dei segnali relativi ai carboni alcolici in posizione 5 (δ 73.0), sia per 86 che per 87. D’altra parte, fra i valori di chemical shift dei segnali relativi ai carboni dei precursori 86 e 87 e quelli dei corrispondenti ulosidi 81 e 82 vi è un ottimo accordo, ad eccezione per quelli assegnati ai carboni C-4 e C-6 sull’unità D-xilo, che nei prodotti ottenuti risultano più
deschermati (4-5 ppm) a causa dell’effetto anisotropico del carbonile in posizione alfa. Questo effetto è evidenziabile anche negli spettri protonici nei quali i segnali relativi ai protoni H-4, H6a e 6b risuonano a campi più alti. Inoltre le molteplicità dei segnali relativi ai protoni H-4, H-6a e H-6b (81: δ 4.45-4.3H-4, J3,4 1.7 Hz; 82: δ 4.65 (H-6b), 4.50 (H-6a), 4.45 (H-4), J3,4
1.8 Hz;) fa notare la perdita dell’accoppiamento con il protone H-5, confermando l’ossidazione in tale posizione.
I derivati chetonici 81 e 82 così ottenuti sono stati sottoposti, senza ulteriore purificazione, alla successiva reazione di sblocco delle posizioni C-1, C-2 e C-3. La rimozione della funzione dimetilacetalica al C-1 e isopropilidenica al C-2 e C-3, con conseguente esposizione della funzione aldeidica, ha portato alla formazione dei derivati disaccaridici 1,5-dicarbonilici 83 e 84. (Schema 21).
Per realizzare l’idrolisi acida delle funzioni acetaliche è stato indispensabile utilizzare condizioni sperimentali che consentano di rimuovere questi gruppi protettivi senza scindere il legame glicosidico. Anche se il prolungato riscaldamento con soluzioni acquose di AcOH può essere sufficiente a realizzare questa operazione, come anche osservato nella formazione molto minoritaria di prodotti di idrolisi completa durante la deprotezione selettiva per ottenere 86 e 87, si è scelto di utilizzare l’acido trifluoroacetico (CF3COOH) al 90% acquoso a
temperatura ambiente, che riduce fortemente i tempi di reazione, garantisce un’idrolisi completa e può essere allontanato con facilità per semplice co-evaporazione con toluene a causa della sua elevata volatilità. E’ inoltre noto che CF3COOH al 90% non è un reagente in
grado di scindere i legami interglicosidici.
Trattando i 5-cheto derivati 81 e 82 (Schema 21) con CF3COOH al 90% a temperatura
ambiente per 2-3 ore si ottiene un grezzo di consistenza sciropposa, dopo coevaporazione con toluene. Sebbene l’analisi NMR (1H e 13C) del grezzo sia molto complessa, a causa della presenza di più forme tautomeriche in equilibrio tra loro, derivanti da emiacetalizzazione dei gruppi alcolici sulle due diverse funzioni carboniliche (chetonica e aldeidica), ci consente di verificare la rimozione dei gruppi isopropilidenici e dimetil acetalici.
Resta inoltre da sottolineare che il grezzo di idrolisi non è sottoposto a processi di purificazione cromatografica a causa della scarsa stabilità su silice dei composti dicarbonilici, che, comunque, possono essere conservati per alcune settimane a bassa temperatura (-18°C).
3.4. - Amminociclizzazione dei derivati 1,5-dicarbonilici 83 e 84
I composti esos-5-ulosici 83 e 84 sono stati quindi sottoposti a reazione di doppia amminazione riducente intramolecolare per formare il nucleo poliidrossipiperidinico della DNJ ed ottenere derivati parzialmente protetti dei mimici disaccaridici in cui l’unità DNJ è legata con un legame interglicosidico β-(1→4) ad unità di MaNAc, nel caso si parta da 83, e di GlcNAc, quando si parte da 84.
Questo approccio sintetico, come riportato nei capitoli precedenti (paragrafi 2.1 e 2.2), è stato ampiamente applicato a composti 1,5-dicarbonilici sia mono- che disaccaridici. La reazione prevede l’uso di ammoniaca o di un ammina primaria in presenza di riducenti in ambiente debolmente acido. Come sistema riducente si può utilizzare H2 e catalizzatore,
secondo le condizioni delle normali idrogenazioni catalitiche, oppure si può procedere per via chimica con l’uso di idruri. L’idruro di scelta per queste reazioni è il cianoboroidruro (NaBH3CN), che in condizioni debolmente acide ha una chemoselettività molto elevata per la
riduzione dei doppi legami imminici, mentre è capace di ridurre i doppi legami carbonilici solamente a pH molto più bassi. Basandoci anche su quanto descritto,8,14 l’amminociclizzazione di 83 e 84 è stata condotta con NaBH3CN in MeOH a 60°C
impiegando un’ammina primaria lipofila avente un sostituente facilmente rimuovibile quale la benzilammina. Schema 22 O O H OH O H OR R'O O C H N H OH OH O H OR R" O N OH O H OR R" R'O H H+ O N H OH O H OR R'O R" N OH O H O CH2OR' OR R" H H+ N OH O H O H CH2OR' OR R" H N OH O H OR R" R'O H N O H OH R" OR' OR R'O N O H OH OR R" OR' R"-NH2 . . . . : . . 89 89a 89b 89c 89d 89e 89f 90a 90b + + +
Il meccanismo comunemente accettato per questo tipo di reazioni (Schema 22) prevede un primo attacco dell’azoto amminico sul più reattivo gruppo aldeidico del chetoaldoso 89, con successiva eliminazione di una molecola d’acqua a formare l’intermedio imminico 89b, il quale è ridotto ad opera del NaBH3CN all’ammina 89c. L’intermedio 89c ciclizza poi
attraverso l’attacco dell’azoto sul gruppo chetonico e, per successiva eliminazione di una molecola d’acqua, si forma il catione imminio ciclico 89f; questo infine, nello stadio stereo-determinante della reazione subisce l’attacco nucleofilo di uno ione idruro a dare gli azapiranosi epimeri al C-5 90a, b.
Si è notato che, mentre le reazioni di amminociclizzazione di derivati dell’L
-arabino-esos-5-ulosio 89 (OH-4 assiale) con differenti ammine primarie conducono sempre a miscele dei due 1-desossi-azapiranosi epimeri 90a (stereochimica D-galatto) e 90b (stereochimica L
-altro), le reazioni nelle medesime condizioni di reazione di derivati D-xilo-esos-5-ulosici
(OH-4 equatoriale), quali sono anche i composti 83 e 8(OH-4 di nostro interesse, portano con una selettività molto elevata e spesso completa agli imminopiranosi a configurazione D-gluco
(90a, OH equatoriale).
Una razionalizzazione di questa particolare stereoselettività nella reazione di amminociclizzazione porta a stabilire una sua dipendenza da fattori che possono influenzare la reattività relativa degli ioni imminio ciclici, che sicuramente, a causa della loro elevata flessibilità dovuta alla presenza del doppio legame C=N, si trovano in un equilibrio molto veloce fra i due conformeri a semisedia 2H3 e 3H2 (Figura 21), che, verosimilmente, devono
avere energie non molto dissimili. Figura 21 N R2 X R3 R4 R5 N R2 R3 R5 R4 N R2 R3 R5 X R4 N R3 R2 X R5 R4 H -2H 3 X H -3H 2 A (D-gluco) B (L-ido) a b R4= β-D-ManNAc oppure β-D-2-N3-Glc + +
Supponendo che il trasferimento di idruro abbia uno stato di transizione più simile ai prodotti che ai reagenti, allora la reattività relativa dei due ioni imminio, che determinerà la distribuzione finale dei prodotti, dipenderà dalle interazioni fra i diversi gruppi sostituenti che si svilupperanno negli stati di transizione a conformazione “quasi”-sedia. E’, inoltre noto, che la riduzione degli ioni imminio con idruri è una reazione sotto controllo stereoelettronico che prevede un attacco da una posizione pseudo-assiale per raggiungere, nello stato di transizione, un assetto antiperiplanare fra il doppietto che si forma sull’N e l’incipiente legame σ fra l’idruro ed il C imminico. Su queste basi, la formazione esclusiva dell’azapiranoso a configurazione D-gluco (tipo A) può essere spiegata considerando che l’attacco assiale sulla
presenta, oltre ad una interazione sfavorevole fra il sostituente ossigenato R3 e l’idruro che attacca, una serie di interazioni 1,3-syn-diassiali, come ad esempio quella fra i sostituenti R4 ed R2 L’attacco sul conformero 2H3 (strada a, pro-D-gluco) in cui tutti i sostituenti sono
pseudo-equatoriali, coinvolge uno stato di transizione di più bassa energia. Evidentemente, nella serie arabino, ove il C-4 ha orientamento opposto, venendo meno l’interazione negativa precedentemente descritta si ha un livellamento dell’energia dei due stati di transizione con diminuzione della stereoselettività della reazione di amminociclizzazione.
Come già accennato, i composti 1,5-dicarbonilici 83 e 84 (Schema 23) sono stati sottoposti a reazione di doppia amminazione riducente intramolecolare in MeOH anidro utilizzando il cloridrato della benzilammina (1.0 eq.) in presenza di NaBH3CN (2.2 eq.). In
entrambi i casi, dopo 20 ore a 60°C, l’analisi TLC evidenzia la scomparsa del prodotto di partenza e la formazione di un prodotto nettamente prevalente.
Schema 23 OH O O OH OHC O O X OBn RO BnO Y O OR1 O N OH O H O H R1O X RO Y 83: X= NHAc; Y= H; R=H; 84: X= H; Y= N3; R=Bn; 91: X= NHAc; Y= H;R=H; R1=Bn; 92: X= H; Y= N3; R=R1=Bn; BnNH2 HCl NaBH3CN MeOH Anidro
Le due miscele grezze di reazione sono state, quindi, concentrate a pressione ridotta e sottoposte ai processi di isolamento e purificazione. L’azadisaccaride 92 è stato direttamente purificato per flash cromatografia su colonna di gel di silice e isolato in resa del 69%, calcolata a partire dal dicarbonilico 84. Nel caso del derivato 91, più trattenuto su silice a causa della sua elevata polarità, si è reso è necessario sottoporre il grezzo di amminociclizzazione a reazione di peracetilazione (Ac2O-Py 1:2, 24 ore, temperatura
ambiente, Schema 24)seguita da purificazione flash cromatografica su colonna di gel di silice. Si isola l’azadisaccaride 93 con resa complessiva del 44% calcolata a partire da 83.
Schema 24 N O H O H O O NHAc OH O H OBn BnO N AcO AcO O O NHAc OAc AcO OBn BnO 91 Ac2O/Py (1:2), r.t. 93
Con l’ottenimento degli azadisaccaridi 92 e 93 è stato confermato che l’andamento stereochimico di queste amminociclizzazioni risulta analogo a quanto riportato per altri
derivati a configurazione D-xilo, come ad esempio quello derivato dal lattosio (42)14 e che non
è influenzato né dalla tipologia dell’unità non riducente β-D-ManNAc, presente in 83, o β-D
-2΄-N3-Glc di 84.
Gli azadisaccaridi 92 e 93, non riportati in letteratura, sono stati completamente caratterizzati dal punto di vista chimico-fisico e i dati NMR sono in accordo con le strutture proposte come sarà discusso nel paragrafo successivo.
Per poter disporre degli azadisaccaridi completamente deprotetti per gli appropriati saggi biologici, la parte conclusiva della Tesi ha previsto, in entrambi i derivati (92 e 93), la completa rimozione dei gruppi protettivi e, nel caso di 92, anche la trasformazione del gruppo azidico in acetammidico.
Questo processo è stato completato per il derivato 93, ottenendo il mimico β-ManNAc-(1→4)-DNJ (25), la cui sintesi è stata affrontata prima dal punto di vista temporale.
Per prima cosa si è scelto di rimuovere i gruppi esterei acetilici rimandando la rimozione degli eteri benzilici alla fase finale. Il composto 93 è stato quindi solubilizzato in MeOH e addizionato di una soluzione di MeONa in MeOH (1.33 M). Dopo 4 ore di agitazione a temperatura ambiente, l’analisi TLC ha mostrato la scomparsa del prodotto di partenza e la comparsa di un prodotto largamente maggioritario a Rf minore. La miscela è stata quindi
neutralizzata con NaHCO3 solido, filtrata su strato di celite, concentrata a pressione ridotta e
purificata per flash cromatografia, ottenendo 94 con resa dell’83% (Schema 25). La completa desacetilazione è stata confermata dall’analisi 1H e 13C NMR, dove si osserva la scomparsa dei segnali relativi ai gruppi acetati ad eccezione di quelli relativi al gruppo acetammidico [1H: δ 1.91 (Me); 13C: δ 171.7 (C=O) e 23.1 (Me)].
Schema 25 N AcO AcO O O NHAc OAc AcO OBn BnO N O H O H O O NHAc OH O H OBn BnO H N O H O H O O NHAc OH O H OH O H MeONa/MeOH 93 H2, Pd-C 25 94 HCl .
L’azadisaccaride 94 è stato infine sottoposto a debenzilazione per idrogenazione catalitica, solubilizzandolo in MeOH anidro e acidificando con una soluzione di HCl metanolico all’1% fino a pH 3-4. Si aggiunge, quindi, Pd su carbone al 10% e si lascia in agitazione sotto atmosfera di H2 a temperatura ambiente. Dopo 5 ore l’analisi TLC evidenzia
la scomparsa del prodotto di partenza e la formazione di un prodotto a Rf minore. Dopo
filtrazione del catalizzatore ed evaporazione dei solventi a pressione ridotta si ottiene un grezzo che, all’analisi NMR (1H e 13C), risulta essere costituito esclusivamente dal composto desiderato 25 (resa 98%).
