22
2. Risultati e discussione
Prima Sezione
La prima parte di questa tesi ha riguardato la preparazione di derivati 1,5-dicarbonilici a configurazione L-ribo e la loro condensazione aldolica intramolecolare. L’approccio sintetico utilizzato (Schema 17) è stato studiato inizialmente, per questioni di facilità, a partire dal metil β-D-galattopiranoside (70) ed è stato poi esteso al lattosio (81), suo parente disaccaridico, meno costoso e largamente accessibile commercialmente.
O OBn OBn O H R OH O O H OH R OH O O O R OBn OBn O O OH OBn OBn OH O O H R OBn OBn OMe O OMIP O R O O O H OH OBn BnO O O O O O O (MeO)2CH 71 R= OMe 83 R= Glc 72 R= OMe 85 R= Glc 73 R= OMe 86 R= Glc 75a R= OMe 92a R= Glc 76 77 Schema 17 70 R= OMe 81 R= 4-O-D-glucosio HO MIP = C(CH 3)2OMe HO Glc =
In particolare, la preparazione di aldoesos-5-ulosi a configurazione L-ribo a partire dal lattosio si inserisce in un progetto più ampio di valorizzazione di questo prodotto di scarto dell’industria lattiero casearia dal quale, recentemente, sono stati ottenuti i rappresentanti delle serie stereochimiche L-lixo,20L-arabino21e D-xilo.22
23
2.1. Sintesi di aldoesos-5-ulosi a configurazione L-ribo a partire dal metil βββ-β D -galattopiranoside
Partendo dal metil β-D-galattopiranoside commerciale (70), ed attraverso una sequenza di reazioni messa a punto all’interno del laboratorio nel quale è stata svolta questa tesi,30 è stato preparato il derivato della serie stereochimica talo 72 con buona resa e completa stereoselettività. L’inversione di configurazione al C-2 è stata ottenuta mediante la sequenza di ossidazione-riduzione su un composto selettivamente deprotetto in tale posizione. Il motivo della diastereoselettività facciale della reazione di riduzione è spiegabile se si considera l’orientamento relativo dei sostituenti presenti su 71: tutti sono disposti sulla faccia β ed in questo modo ostacolano l’attacco dell’idruro da quella parte.
2.1.1. Formazione del derivato 4-esenopiranosidico 73
Il derivato talopiranosidico 72 è stato sottoposto ad una reazione di eliminazione base catalizzata, per preparare il composto enoletereo 73. In un primo tentativo sono state impiegate le condizioni messe a punto sui derivati a configurazione galatto che prevedevano il trattamento con tBuOK in DMF ad 80 °C o a temperatura ambiente.24,31 Entrambe le metodiche tuttavia, si sono dimostrate troppo aggressive per il composto in esame, conducendo velocemente ad una miscela non analizzabile di prodotti di degradazione.
Per ovviare a queste problematiche è stato effettuato uno screening di temperature e di solventi che hanno indicato nel THF a riflusso le condizioni di elezione (Schema 18).
O OBn OBn O H OMe O O O OMe OBn OBn 73 72 tBuOK THF riflusso Schema 18
24 La reazione, che procede secondo un meccanismo di tipo E2, deve essere interrotta dopo 15 minuti altrimenti determina la degradazione del prodotto di eliminazione ed ha condotto a 73 in resa eccellente (87%) (Schema 19).
O OBn OBn O H OMe O O O OMe OBn OBn H H 73 tBuOK THF 72 3 5 B -Schema 19
Sebbene nel substrato di partenza ci siano due idrogeni che si trovano disposti in modo antiperiplanare rispetto al gruppo uscente, l’attacco della base risulta completamente regioselettivo. Questa selettività è imputabile alla presenza del ponte isopropilidenico, che probabilmente crea un certo grado di distorsione della molecola, ed impedisce ad H-3 la corretta disposizione.
Il composto 73, non riportato in letteratura, è stato completamente caratterizzato e, in particolare, l’analisi NMR evidenzia la quaternarizzazione (esperimenti DEPT) del C-5 (δ 148.6), la scomparsa dei segnali relativi al ponte isopropilidenico, lo shift a campi più bassi del C-4 (δ 103.9) e, nello spettro protonico, l’assenza del segnale relativo ad H-5, la presenza nella zona degli anomerici di un doppio tripletto relativo ad H-4 (δ 5.14) ed infine un singoletto (δ 2.96) per l'OH-3.
2.1.2. Epossidazione-metanolisi del derivato 4-esenopiranosidico 73
La strategia prevede l’ossidazione formale della posizione 5 per reazione del derivato enoletereo 73 con MCPBA in MeOH; in queste condizioni il metanolo oltre che agire come solvente funziona anche come nucleofilo, e attacca l’epossido intermedio, che viene così aperto dando luogo alla formazione dei derivati bis-glicosidici.
25 La reazione di questa classe di composti con peracidi è stata ben studiata e, in particolare, la presenza di un gruppo alcolico in posizione allilica ha un effetto notevole sulla stereoselettività della reazione.32 Sui derivati della serie galatto si ottiene, infatti, esclusivamente l’epossido derivante dall’attacco del peracido dalla stessa parte dell’ossidrile allilico; questa sin direzionalità di attacco è spiegabile con un legame ad idrogeno che si instaura tra il gruppo alcolico ed il peracido.
Nella serie talo, presa in esame nel nostro caso, la differente stereochimica della posizione 2 determina una minore stereoselettività della reazione, probabilmente per ingombro sterico, e si forma una certa percentuale di epossido derivante dall’attacco sulla faccia α (Schema 20).
O OBn O O H OMe OBn O OBn O O H OMe OBn O OBn O H OMe OBn OH O O H OMe OBn OBn OMe O H O O H MeO OBn OMe OBn MCPBA + 74a 74b 73 Schema 20 75a 75b +
Questi due intermedi non isolabili vengono poi aperti dal metanolo regioselettivamente sul C-5, a causa della stabilizzazione per risonanza del carbocatione (o carbocatione incipiente) derivante dalla presenza dell’ossigeno anomerico (Figura 7), per formare, dopo 3.5 ore a temperatura ambiente, il bis-glicoside 75a come prodotto maggioritario (59% resa) e il bis-glicoside 75b in percentuale minore (21% resa).
26 O O O O OH O OH O OH OR O OH O OR OH H+ + + ROH + ROH Figura 7
I due composti sono stati separati per flash cromatografia e la loro struttura attribuita sulla base dello spettro NMR.
In particolare la costante di accoppiamento tra i protoni H-3 ed H-4 (9.9 Hz) conferma la loro disposizione assiale-assiale relativa e la struttura di 75b. Nel caso di 75a, invece, la scarsa risoluzione dello spettro non consente di determinare inequivocabilmente la stereochimica del C-4 che, così come le due configurazioni al C-5, è stata assegnata sulla base dell’analogia con i rispettivi composti disaccaridici descritti nel paragrafo 2.2.2. e sulla base del successivo prodotto di idrolisi.
2.1.3. Idrolisi dei bis-glicosidi 75a e 75b
I derivati bis-glicosidici sono composti dicarbonilici mascherati, dato che presentano due funzioni acetaliche in posizione 1 ed in posizione 5. Il vantaggio principale di questa classe di composti risiede nella loro elevata stabilità in una vasta gamma di condizioni (basiche, neutre e moderatamente acide) che ne consente l’elaborazione prima di liberare le funzioni carboniliche.
Il trattamento con CF3COOH in una miscela di CH3CN-H2O 2:1, invece, ne provoca
l’idrolisi e permette di ottenere il derivato 1,5-dicarbonilico, e nel nostro caso ha portato a 76 e 94 in resa rispettivamente del 76% e 93% dopo filtrazione su gel di silice
27 OH O OMe O H OMe OBn OBn OH O O H CHO OBn OBn O CHO OBn OBn O H O H O OH OH O BnO O O OH BnO OH O OMe O H OBn O H MeO OBn OBn 75a 76 Schema 21 CF3COOH CH3CN/H2O 75b BnO BnO 94 CF3COOH CH3CN/H2O
In generale i composti 1,5-dicarbonilici si trovano in equilibrio con le rispettive forme cicliche e, se presentano la funzione ossidrilica libera in posizione 4, si ottengono come miscela α e β di forme furanosiche. I derivati a configurazione L-ribo 76 e D-lixo 94, quindi, sono stati ottenuti come miscela furanosica α/β in rapporto 70:30 e 66:34 rispettivamente, i cui dati NMR corrispondono perfettamente a quanto riportato in letteratura.30,26
2.2. Sintesi di aldoesos-5-ulosi a configurazione L-ribo a partire dal lattosio
Un approccio sintetico, studiato precedentemente nel nostro laboratorio, che consentisse una via d’accesso a derivati dicarbonilici della serie L-ribo a partire dal lattosio prevedeva di effettuare l’ossidazione formale della posizione 5 per epossidazione-metanolisi non di 4-eseno bensì di 5-esenopiranosidi.
Sul substrato di partenza 78 era stata, quindi, invertita la configurazione al C-2’, ma il successivo tentativo di eliminazione aveva fornito l’anidro zucchero 80 in luogo del desiderato 5-esenopiranoside anche in presenza di gruppi protettivi eterei in posizione 2’ (Schema 22).
28 O O O OTs Glc OH O O O OTs Glc OR O Glc O O O O O O O O (MeO)2CH
i: 1) TPAP, NMO, CH2Cl2; 2) NaBH4, MeOH; ii: NaH, DMF. i Schema 22 80 ii 79a R=H 79b R=Bn 78 Glc =
Viste le problematiche incontrate e considerati i buoni risultati ottenuti nella serie monosaccaridica, in termini di resa e facilità sintetica, passando per l’enoletere 4-esenopiranosidico, si è deciso di esplorare questa strada anche per il lattosio.
Come prodotto di partenza è stato utilizzato 85, analogo disaccaridico di 72. Questo precursore è stato preparato facilmente secondo quanto sviluppato nel laboratorio33 per acetonazione del lattosio (81) con DMP e TsOH, che conduce al derivato selettivamente deprotetto in posizione 2’ 82, seguita da ossidazione-riduzione, rimozione del gruppo protettivo MIP (metossi isopropile) presente sulla posizione 6’ e finale benzilazione dei due gruppi ossidrilici (Schema 23).
29 O O OBn Glc O OBn O OH O O H OH O OH OH O H OH OH O O OMIP Glc O OH O O OMIP Glc O OH O OMIP O Glc O O DMP TsOH 1) AcOH 0,1N 2) BnBr, NaH 81 82 84 85 Schema 23 83 NaBH4 MeOH
2.2.1. Formazione del derivato 4-esenopiranosidico 86
Il trattamento di 85 con tBuOK in THF a riflusso ha portato anche in questo caso alla formazione del derivato 4-esenopiranosidico 86 come unico prodotto ed in eccellente resa (81%) dopo purificazione cromatografica (Schema 24).
O OBn O H Glc OBn O O OBn Glc O OBn Schema 24 85 86
Il composto è stato completamente caratterizzato e, nello spettro NMR, i segnali relativi all’H-4’ vinilico e al C-4’ e C-5’ [δ 5.17, 102.9 e 149.0 (quaternario), rispettivamente] confermano la struttura 4-esenopiranosidica.
30 È interessante osservare la differenza di comportamento rispetto al derivato della serie
galatto 87, con il quale nelle stesse condizioni di reazione si recupera il prodotto di
partenza non reagito.
Per tale composto, infatti, è necessario effettuare la reazione con tBuOK in DMF a temperatura ambiente per ottenere il composto desiderato 90 in resa del 65% accompagnato, però, dai prodotti di degradazione 88 e 8931 (Schema 25).
O OBn O H OBn O (OMe)2CH O O OH O O OBn Glc O OBn O O O O H O (OMe)2CH O OBn O H Glc OBn 88 87 tBuOK, DMF 89
+
Schema 25 90+
Questo differente comportamento è probabilmente imputabile alla presenza in 85 del gruppo 2’-OBn assiale ed alla sua interazione con il ponte isopropilidenico sui carboni 3’ e 4’, che incrementa la reattività dei derivati della serie talo verso le condizioni basiche e consente di operare in condizioni più blande tali da evitare la formazione di sottoprodotti.
2.2.2. Epossidazione-metanolisi del derivato 4-esenopiranosidico 86
Il derivato enoletereo 86 è stato sottoposto alla reazione di epossidazione-metanolisi, portando alla formazione della miscela di bis-glicosidi diastereoisomeri 92a e 92b
31 rispettivamente in percentuale del 58% e del 16% in analogia con quanto visto in serie monosaccaridica (Schema 26). O OBn OBn O H Glc OH O OBn OBn Glc O H OMe O OBn Glc O H MeO OBn O H O OBn OBn O H Glc O O OBn OBn O H Glc O 86 91a 91b 92a 92b MCPBA MeOH + Schema 26
La struttura di 92a è stata assegnata in base allo spettro NMR: la costante di accoppiamento tra i protoni H-3’ e H-4’ ha un valore di 3.0 Hz, valore tipico per un accoppiamento assiale-equatoriale. Nel caso di 92b la costante di accoppiamento tra H-3’ e H-4’ ha un valore decisamente maggiore rispetto al precedente (J3’,4’ 10.0 Hz) che
indica la disposizione assiale-assiale dei due protoni. La trasformazione di 92a in 93 per trattamento con TsOH in DMP (resa 93%) ha permesso di assegnare inequivocabilmente anche la configurazione del C-5’. Questa reazione consente di ottenere, infatti, un prodotto precedentemente caratterizzato in cui la configurazione assoluta del C-5’ è stata attribuita tramite esperimenti NOE (Schema 27).
OH Glc O O H OMe OBn OBn O Glc O O OMe OBn OBn 92a Schema 27 DMP TsOH 93
32
2.2.3. Idrolisi dei bis-glicosidi 92a e 92b
L’idrolisi acida finale di 92a e 92b con CF3COOH in CH3CN-H2O porta, dopo
separazione dal D-glucosio per estrazione con AcOEt e filtrazione su gel di silice, alla formazione dei derivati 1,5-dicarbonilici a configurazione L-ribo 76 e D-lixo 94 con una resa del 73% per entrambi i composti. In soluzione essi si trovano in equilibrio con le forme furanosiche α/β come visto in precedenza (Schema 28).
OH Glc O O H OMe OBn OBn O H O Glc O H MeO OBn OBn O OH O O OBn OH O OH O O OBn OH 92b Bn 76 94 Bn Schema 28 CF3COOH CH3CN/H2O 2:1 CF3COOH CH3CN/H2O 2:1 + glucosio + glucosio 92a
La via sintetica risulta quindi compatibile anche con i derivati disaccaridici, che danno luogo alla formazione dei prodotti attesi con rese paragonabili ai derivati della serie monosaccaridica. In questo modo siamo riusciti a verificare la fattibilità della serie di reazioni anche su molecole che, rispetto alle precedenti, presentano ulteriori punti di fragilità sulla porzione protetta del glucosio.
2.3. Condensazione aldolica intramolecolare
In questo paragrafo vengono presentati i risultati relativi alla reazione di condensazione aldolica intramolecolare, effettuata su derivati 1,5-dicarbonilici a configurazione L-ribo
33
76. La reazione di ciclizzazione, condotta in CH2Cl2 con DBU come promotore, avviene
con completo controllo sui due nuovi centri stereogenici generati. Differenti repliche della reazione sono state eseguite variando le condizioni con lo scopo di migliorare la resa finale, ottenendo tuttavia risultati analoghi (36% resa) (Schema 29). Analizzando lo spettro NMR di 77 si può notare come in esso sia presente un segnale δ 207.5 (C-1) diagnostico della funzionalità chetonica. Nello spettro protonico si evidenziano due doppi doppietti a δ 4.26 e 4.21 che nello spettro COSY risultano correlati da una costante di accoppiamento di 1.4 Hz, tipica di un accoppiamento long range fra i due protoni in α al carbonile fra loro paralleli, identificabili rispettivamente come 6 ed H-2; entrambi inoltre presentano un’altra costante di accoppiamento (J5,6 3.7 Hz) e (J2,3 3.4
Hz) dovuta all’accoppiamento con due protoni H-5 ed H-3 disposti equatorialmente. Come visto per le altre serie stereochimiche, quindi, i sostituenti presenti sui due nuovi stereocentri (2 e 3) vengono a trovarsi in sin rispetto a quello che si trova sulla posizione 6 [la numerazione è riferita al composto (77)].
O OH OBn CHO OH O O H OBn DBU CH2Cl2 1 2 3 4 5 6 76 77 Schema 29 OBn HO BnO HO
Per dare un spiegazione a questo tipo di selettività sono stati cercati degli esempi analoghi riportati in letteratura. Un caso correlato di reazione aldolica intramolecolare di composti 1,5-dicarbonilici viene riportato da Tadano34 (Schema 30).
34 O R O O O O CH3 CH3 O R O OH O O CH3 CH3 H O OH H H H O R DBU Benzene riflusso 4 2 1 Schema 30
Il prodotto ottenuto nella reazione è caratterizzato dalla stessa orientazione 1,2,4 cis presente nel nostro caso. Per razionalizzare questo tipo di risultati gli autori si rifanno alle regole topologiche proposte da Seebach e Golinski,35 per spiegare la formazione preferenziale del composto a configurazione treo nel caso della condensazione di Michael dell’accettore 95 con il donatore 96 (Figura 8).
I punti da rispettare sono i seguenti:
a) Sfalsamento di tutti i legami attorno a quello di nuova formazione
b) Il legame C=C del donatore deve trovarsi gauche rispetto ai legami C=A e C-H dell’accettore
c) Il sostituente meno ingombrato presente sul donatore (l’atomo di idrogeno) deve trovarsi in posizione antiperiplanare rispetto al legame C=A
Lo stato di transizione generale A, nel nostro caso viene modificato in B, a causa della natura intramolecolare della reazione che non permette di seguire il punto b).
35 H R2 O R3 A R1 H O H H O OBn -C C O O H OH H H OBn δ- δ -R A H Y R3 R2 H A H R1 H R2 R3 Y -A B Figura 8 + 95 96 4 6 1
Tuttavia questo modello non sembra adattarsi alle esigenze del nostro caso, in quanto non permette di stabilire alcuna correlazione tra il sostituente sulla posizione 4 e quelli sulle posizioni 1 e 6.
Per dare una migliore spiegazione del decorso stereochimico della reazione abbiamo preso in considerazione modelli di stati di transizione aciclici comunemente accettati. Questi prevedono, in assenza di coordinazioni dovute a specie metalliche, un’orientazione antiperiplanare dell’enolato e del gruppo carbonilico e sono stati proposti come razionale per quelle reazioni in cui si verifica la formazione di addotti
36 R2 H O R3 R2 O R3 OH R1 O H R1 H R2 O R3 O R1 H R2 H O R3 R2 O R3 OH R1 O R1 H H R2 O R3 O H R1 -δ δ -δ δ -Z anti E sfavorito -δ δ -δ δ -Z E sin favorito Figura 9
Formazione di aldoli sin indipendentemente dalla geometria dell'enolato.
Questo tipo di risultati sono stati osservati in reazioni aldoliche di enolati di stagno, zirconio ed enolati “nudi” generati da enolsilani.37 La spinta termodinamica verso questo stato di transizione aciclico è data dalla tendenza dei due atomi di ossigeno carichi negativamente a stare il più possibile distanti l’uno dall’altro.
Secondo queste linee viene mostrato in Figura 10 il possibile modello dello stato di transizione per il nostro caso, che prende in considerazione anche la disposizione cis tra i sostituenti in 1,4 e 6.
37 H OR
-δ
δ -
H O O OR 4 5 6 1 2 3 Figura 10È possibile supporre che la disposizione assiale dei sostituenti elettron-attrattori presenti sulle posizioni 4 e 6, diminuendo la concentrazione di carica negativa sul legame C-5(O), diminuisca l’energia totale dello stato di transizione, favorendo così la reazione intramolecolare. Effetti induttivi di questo tipo, in sistemi ciclici, sono già stati evidenziati.38 Inoltre, mediante questa assunzione, si può spiegare la differenza in termini di resa, della condensazione per le coppie lixo-arabino (a) (70%) e ribo-xilo (b) (35%).
Infatti, Figura 11, nel primo caso il sostituente in posizione 2 ha un’orientazione di tipo equatoriale e si ottengono ottime rese, mentre nel secondo le interazioni 1,3-sin diassiali con i sostituenti presenti sulle posizioni 4 e 6 molto probabilmente determinano un aumento di energia dello stato di transizione che provoca reazioni collaterali.
H OR -δ δ - H O O OR H OR -δ δ - H O OR O OR 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 OR
L-lixo e L-arabino L-ribo e D-xilo
a b
38
2.3.1. Riduzioni stereoselettive dell’inosone 77
Gli inosoni sono intermedi sintetici interessanti, data la loro polifunzionalità, e possono essere impiegati come precursori di differenti classi di composti. Le modifiche più semplici e dirette riguardano la funzionalità chetonica che può essere ridotta per dar luogo alla formazione di inositoli, o per amminazione riduttiva ad inosammine, entrambe classi di composti bioattivi. La procedura utilizzata, ed ampiamente sperimentata all’interno del nostro laboratorio, prevede l’utilizzo di NaBH4 e
NaBH(OAc)3 come agenti riducenti complementari che danno luogo selettivamente alla
formazione dei derivati del cis- e dell’epi-inositolo rispettivamente (Schema 31).
OH O O H OBn OH O H OBn OH OAc AcO OBn OAc OH O H OBn O H OAc AcO OBn AcO NaBH4 Ac2O Py NaBH(OAc)3 cis-inositolo epi-inositolo Schema 31 HO OBn HO OBn OBn HO OBn 77 97 98 99 AcO OBn Ac2O Py 100 AcO
Nel dettaglio, l’inosone 77 solubilizzato in MeOH, e raffredato a 0°C viene trattato con NaBH4. La reazione viene mantenuta a temperatura costante (0 °C) e controllata per
TLC (CHCl3-MeOH 9:1) fino ad osservare la completa scomparsa del prodotto di
partenza e la formazione di un nuovo composto ad Rf più basso. La reazione viene
trattata aggiungendo la resina acida Amberlist 15 fino a neutralità. Il grezzo di reazione viene sottoposto direttamente ad acetilazione per aggiunta di Ac2O-Py in rapporto 1:2.
39 Dopo 48 ore il grezzo viene purificato per flash cromatografia (esano-AcOEt 1:1) e fornisce 98 puro con una resa del 70%. La riduzione dell’inosone è confermata dalla presenza del segnale relativo al protone H-6. La presenza di un piano di simmetria nella molecola semplifica lo spettro protonico e sono presenti i segnali relativi all’H-2 (multipletto a δ 5.80), all’H-4 e all’H-6 (multipletto a δ 5.60), all’H-5 (multipletto a δ 4.91), all’H-1 ed all’H-3 (multipletto a δ 3.74).
La selettività della riduzione con NaBH4 è spiegabile valutando la disposizione relativa
di tutti i sostituenti presenti sull’anello; la “faccia β” risulta completamente inaccessibile per un reagente ingombrato quale è il NaBH4, che attaccherà con direzione
equatoriale da parte opposta (Figura 12).
OH O O H OBn H -1 2 3 4 5 6 Figura 12 77 OBnHO
La riduzione alternativa è stata effettuata solubilizzando l’inosone (77) in CH3CN ed
aggiungendo NaBH(OAc)3 ed AcOH. Sull’inosone è presente un ossidrile libero in β
rispetto al carbonile, e grazie a questa caratteristica strutturale è possibile ottenere il prodotto di riduzione complementare al precedente. Il NaBH(OAc)3 infatti, è in grado di
coordinarsi ad uno degli ossidrili liberi in posizione assiale presenti sulla struttura e dare così un trasferimento interno di idruro, attraverso una struttura intermedia di tipo ciclico a sei membri, dalla stessa parte dei sostituenti in 3 e 5, dando così luogo alla formazione del derivato dell’epi-inositolo (Schema 32).
40 OH O H OBn O H BnO OH O O H OBn O O O H OBn B H OAc AcO Schema 32 HO OBn NaBH(OAc) 3 CH3CN, AcOH HO OBn 77 99 HO
La reazione risulta completa dopo 3 ore e 40’, ed il grezzo risultante viene acetilato direttamente (Ac2O-Py 1:2) per formare il derivato 100 con una resa del 72% a partire
da 77 (Schema 33). Il risultato della reazione viene confermato dall’interpretazione dello spettro NMR, in cui, oltre alla comparsa dei singoletti relativi ai protoni dei gruppi acetilici (1H NMR: δ 2.10, 2.09, 1.99 e 1.94) è presente un doppio doppietto con costanti di accoppiamento particolarmente elevate (J1,2 10.6 Hz, J1,6 10.2 Hz) che
indicano la disposizione assiale-assiale dei tre protoni interessati (H-1, H-2 ed H-6).
OH O H OBn O H OAc AcO OBn AcO 99 100 BnO AcO BnO HO Schema 33 Ac2O/Py 1 2 3 4 5 6
41
Seconda sezione
La seconda parte del lavoro svolto in questa tesi ha riguardato la sintesi di un derivato del D-pinitolo selettivamente protetto, utilizzabile come mimico della struttura semplificata del polisaccaride capsulare dello Streptococcus Pneumoniae 19F; la sostituzione dell’unità terminale di α-L-ramnosio del polisaccaride capsulare con il D -pinitolo, con la conseguente rimozione della porzione anomerica, permette l’ottenimento di mimici più stabili rispetto al polisaccaride nativo (Figura 13).
O P O O O O H O H O OHO O OH NHAc O O H OH OH O Me OH OH O HMeO O H polisaccaride capsulare Figura 13 porzione α α α α-L-ramnopiranosica D-pinitolo 1 2 6 4 3 5HO -n
Studi computazionali eseguiti sulle strutture dell’α-L-ramnopiranosio e del D-pinitolo, atti ad analizzare lo spazio conformazionale delle due molecole considerando tutti i loro gradi di libertà, ed eseguiti con particolare attenzione rispetto alla possibilità di formazione di legami ad idrogeno intramolecolari, rivelano come per entrambe le strutture sia preferita la conformazione 1C4 e quella di tipo 1C4.
Anche lo spettro 1H-NMR ad alti campi (600 MHz) in D2O del D-pinitolo [J1,2 (9.9 Hz),
J1,6 (9.6 Hz), J5,6 (9.9 Hz), J2,3 (2.9 Hz) e J4,5 (2.8 Hz)] conferma quanto evidenziato
dagli studi computazionali,29 ovvero la disposizione equatoriale di quattro sostituenti nel conformero maggiormente presente all’equilibrio (Figura 14).
42 OH OH O H O H O OH OH OH O OH OH OH O H O H OH MeO OH OH OH OH OH OMe 4C 1 1C 4 4C 1-simile 1C 4-simile Figura 14
Un’altra serie di analisi computazionali hanno riguardato la struttura semplificata del polisaccaride capsulare A e del suo mimico B. Anche per questa serie di composti è preferita la conformazione 1C4, inoltre le due strutture hanno una buona analogia anche
nei valori degli angoli torsionali più vicini all’anello.29 Sulla base di questi dati computazionali, che indicano una buona similarità tra le due strutture abbiamo deciso di affrontare la sintesi di B (Figura 15).
O O O H C H3 O H O CH3 P O O O R O O O H O O H OH CH3 P O O O R C H3 B Figura 15 A 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 -
-43
2.4. Preparazione di analoghi dell’unità αα-αα L-ramnopiranosica
Come osservato nel capitolo precedente, la reazione di condensazione aldolica intramolecolare di derivati aldoesos-5-ulosici seguita da riduzione stereoselettiva, permette di ottenere il controllo su tre dei sei stereocentri presenti sugli inositoli. In base a questi risultati, nello (Schema 34) viene riportato il nostro approccio retrosintetico per la sintesi del D-pinitolo ortogonalmente protetto.
OH O OAll CHO OMe ONap OH O OAll ONap OMe OMe O H O H MeO OH ONap 101 102 103 Schema 34 OAll HO
2.4.1. Sintesi del 5-esenopiranoside 107
La sintesi del precursore bis-glicosidico 103 viene eseguita ancora una volta a partire dal metil β-D-galattopiranoside (70) per trattamento con DMP in TsOH che porta alla formazione di 104. La procedura adottata in questa reazione è stata ampiamente sperimentata e non presenta inconvenienti di nessun tipo.
Il composto ottenuto viene trattato con NaH ed un leggero eccesso di NAPBr in DMF per arrivare così al derivato protetto sulla posizione 2 105. L’idrolisi dell’acetale metossi-isopropilico, caratterizzato da un’elevata labilità anche in condizioni debolmente acide, per trattamento con HCl 0.1 N e la successiva tosilazione della posizione libera portano alla formazione del derivato completamente protetto (106) in buona resa. A questo punto si può notare una differenza rispetto alla strategia adottata per la sintesi dei derivati dicarbonilici utilizzati precedentemente, in quanto i tentativi di effettuare la reazione di eliminazione con tBuOK su derivati della serie galatto ortogonalmente protetti analoghi di 64, ha dato risultati negativi; la presenza in posizione 6 di un buon gruppo uscente, fa sì che il trattamento di 106 con una base porti esclusivamente alla formazione del 5-esenopiranoside 107, caratterizzato dalla presenza
44 di un doppio legame esociclico. La procedura messa a punto prevede l’utilizzo di NaH in DMF, ottenendo in questo modo l’enol etere 107 con una resa del 92% dopo purificazione flash cromatografica (Schema 35).
O O O OMe OMIP OH O O H OH OH OH OMe O O O OMe OMIP ONap O O O OMe OTs ONap O ONap O O OMe Schema 35 70 104 105 106 107 DMP TsOH NaH NAPBr 1) HCl 0,1N 2) TsCl, CH2Cl2-Py 1:1 NaH DMF
2.4.2. Epossidazione-metanolisi del derivato 5-esenopiranosidico 107
La reazione di epossidazione-metanolisi, come visto nei casi precedenti, senza effetti dirigenti risulta essere non del tutto selettiva e si formano entrambi i possibili epossidi intermedi che vengono aperti dal solvente/nucleofilo sulla posizione più elettrofila. Si ottiene quindi, una miscela di bis-glicosidi 108. Questa diminuzione di selettività tuttavia non influisce negativamente sull’andamento complessivo della sintesi, in quanto, come si vedrà in seguito, la miscela di bis-glicosidi viene sottoposta a riequilibratura in condizioni acide (Schema 36).
O O O OMe ONap O O O ONap OH MeO OMe Schema 36 107 108 MCPBA MeOH
45 L’allilazione dell’ossidrile libero e l’idrolisi del ponte isopropilidenico portano alla formazione dell bis-glicoside 103. In particolare la rimozione dell’ anello diossolanico, nel passaggio da 109 a 103, può essere ottenuta selettivamente rispetto ai legami glicosidici per trattamento con TsOH in MeOH a temperatura ambiente. In questo step si ha inoltre una equilibrazione dei bis-glicosidi, presenti come miscela anomerica, verso quello più stabile, in cui il metossile si trova in posizione assiale ed il gruppo allilico, più ingombrante, risulta disposto equatorialmente (Schema 37).
O O O ONap OH MeO OMe O O O ONap OAll MeO OMe O O H OH ONap OMe OMe OAll 108 CH2=CHCH2Br NaH, DMF 109 TsOH MeOH 103 Schema 37
2.4.3. Metilazione della posizione 4 di 103
Dopo aver ripercorso la sequenza sintetica già messa a punto in laboratorio, fino ad ottenere 103, è risultato necessario introdurre sulla posizione 4 un gruppo metilico. La differenziazione diretta dei due ossidrili risulta molto complicata, per questo motivo si è scelto di passare attraverso l’utilizzo di un gruppo protettivo temporaneo sul C-3 che fosse facilmente rimovibile una volta raggiunto lo scopo. La scelta è caduta sulla procedura messa a punto da David e Hanessian,39 che permette di differenziare due ossidrili vicinali cis tra loro. La metodica prevede il trattamento del prodotto con Bu2SnO in toluene a riflusso per 2 ore in condizioni di rimozione azeotropica dell’acqua
che si forma durante la reazione e l’aggiunta successiva di BzCl per ottenere selettivamente il derivato benzoilato sulla posizione 3 110. Il grezzo di reazione viene
46 trattato con soluzione satura di NaHCO3 e la fase organica estratta con AcOEt. Il prodotto
viene purificato per flash cromatografia (esano-AcOEt 75:25) ed ottenuto puro con una resa del 90%. La struttura di 110 è confermata tramite l’analisi dei dati NMR in cui risulta particolarmente evidente lo shift a campi più bassi dell’H-3, dovuto alla presenza, rispetto a 103, del gruppo benzoilico che porta ad un evidente effetto deschermante. In questo modo si riesce ad accedere ad una struttura che può essere sottoposta a metilazione diretta per trattamento con NaH in DMF anidra e CH3I. La reazione viene condotta sotto
atmosfera inerte e controllata tramite TLC (esano-AcOEt 7:3) fino ad osservare la scomparsa del prodotto di partenza (30 min). Condizione necessaria per il successo della reazione è quella di lavorare in ambiente anidro: il gruppo benzoilico infatti in questo ambiente risulta stabile per la durata della reazione; diversamente se si lavorasse in presenza di acqua, questa venendo a contatto con l’idruro formerebbe OH- che provocherebbero l’idrolisi dell’estere. Il trattamento prevede la distruzione del NaH non reagito per aggiunta di MeOH, mantenendo in agitazione e raffreddando a 0 °C e la successiva estrazione della fase organica con CH2Cl2. Il prodotto ottenuto viene
direttamente sottoposto a transesterificazione per trattamento con MeONa-MeOH; la reazione risulta conclusa dopo 7 ore, la miscela viene neutralizzata per aggiunta di Amberlist 15 (resina acida), la soluzione viene filtrata ed il solvente evaporato a pressione ridotta. Il composto viene purificato per flash cromatografia (esano-AcOEt 7:3) e si ottiene 112 puro con una resa del 74% (Schema 38).
O O H OH ONAP OAll OMe OMe O O H ONAP OAll OMe OMe OMe O OH ONAP OAll OMe BzO OMe O ONAP OAll OMe BzO OMe OMe a) Bu2SnO toluene b) BzCl NaH, DMF CH3I MeONa MeOH 103 Schema 38 112 110 111
47
2.4.4. Inversione di configurazione del C-3
La sequenza di reazioni successiva è mirata ad ottenere l’inversione di configurazione sul C-3 e viene eseguita tramite ossidazione, utilizzando il sistema TPAP-NMO, e successiva riduzione. La reazione di ossidazione viene condotta sotto atmosfera inerte ed utilizzando solventi anidri. Il work-up prevede la filtrazione della miscela di reazione per eliminare il catalizzatore e l’evaporazione a pressione ridotta del solvente in eccesso. Il prodotto ottenuto 113 viene sottoposto direttamente e senza ulteriori purificazioni alla riduzione per trattamento con NaBH4 in MeOH. La reazione è
condotta a 0 °C e risulta essere completa dopo solo 20 minuti e con assoluta stereoselettività; la selettività è ascrivibile alla presenza del metossile assiale in posizione 5 che scherma l’ingresso dell’idruro da quella parte conducendo esclusivamente al derivato bis-glicosidico della serie L-lixo 114 con una resa complessiva per la sequenza di ossidazione-riduzione del 73%, calcolata dopo purificazione flash cromatografica del prodotto risultante (Schema 39).
O O H ONAP OAll OMe OMe OMe O O ONAP OAll OMe OMe OMe O OH ONAP OAll OMe OMe OMe Schema 39 112 113 114 TPAP 5% NMO CH2Cl2 NaBH4 MeOH
La struttura di 114 viene confermata confrontando lo spettro NMR con quello di 112 e valutando le costanti di accoppiamento protonico (Tabella 2).
Tabella 2. Valori delle costanti di accoppiamento (J, Hz)
J1,2 J2,3 J3,4
112 (L-arabino) 7.9 7.9 3.2
48 Come si può notare dai valori riportati, risulta evidente soprattutto la variazione nella costante di accoppiamento J2,3 che per il derivato L-arabino 112 è di 7,9 Hz, dovuta
all’accoppiamento dei due protoni di tipo assiale-assiale, mentre per il prodotto della riduzione 114 si ottiene un valore nettamente inferiore (3,6 Hz) ed imputabile all’orientazione assiale-equatoriale dei due protoni.
La successiva idrolisi acida di 114 eseguita per trattamento con CF3COOH in una
miscela di CH3CN-H2O 2:1 alla temperatura di 60 °C porta alla formazione del derivato
dicarbonilico corrispondente 102, come miscela complessa di forme tautomeriche. A differenza dei composti 1,5-dicarbonilici trattati in precedenza, in questo caso non è possibile ottenere la forma furanosica in quanto il gruppo ossidrilico che dovrebbe operare la ciclizzazione risulta protetto come metil etere (Schema 40).
O OAll ONap OMe OMe OH OMe O OAll ONap OH OMe CHO Schema 40 CH3CN-H2O 2:1, CF3COOH, 60°C 114 102
2.4.5. Condensazione aldolica intramolecolare
Il successivo step di condensazione viene eseguito direttamente sul grezzo di reazione, in quanto la classica procedura cromatografica su silice porterebbe a parziale degradazione del prodotto. La condensazione viene condotta per trattamento di una soluzione di 102 in CH2Cl2 anidro e sotto atmosfera inerte con DBU come promotore
della reazione (Schema 41). L’andamento stereochimico è quello atteso ed i due nuovi stereocentri generati (posizioni 2 e 3) vengono a trovarsi in cis rispetto al gruppo –OMe presente sulla posizione 6. La purificazione del grezzo viene eseguita per flash cromatografia (esano-AcOEt 4:6) ed il prodotto 115 viene ottenuto puro con una resa del 65%.
49 O OAll ONap OH OMe CHO O MeO OH ONap Schema 41 102 115 OAll HO DBU CH2Cl2
L’analisi dello spettro NMR di 115 dà la conferma dell’effettiva formazione dell’inosone; si può notare come sia presente un segnale indicativo del gruppo carbonilico a δ 204.6 (C-1), inoltre il valore delle costanti d’accoppiamento tra i protoni presenti sui nuovi stereocentri rivela la disposizione relativa dei sostituenti: J2,3 3.3 Hz
(accoppiamento assiale-equatoriale), J3,4 3.5 Hz (accoppiamento
equatoriale-equatoriale), J4,5 3.2 Hz (accoppiamento equatoriale-assiale), J5,6 9.9 Hz (accoppiamento
assiale-assiale).
2.4.6. Riduzione stereoselettiva di 115
Una volta ottenuto l’inosone 115 si procede alla riduzione (Schema 42). Il solido di partenza viene disciolto in CH3CN distillato ed in sequenza si aggiungono NaBH(OAc)3
e CH3COOH. Dopo 4 ore la reazione risulta essere completa ed il trattamento prevede
l’estrazione della fase organica con AcOEt. La purificazione flash cromatografica porta all’ottenimento del composto 101 con una resa del 72%.
O H MeO OH ONap O MeO OH ONap 115 101 NaBH(OAc)3 CH3COOH CH3CN OAll HO 1 2 3 4 5 6 OAll HO 1 2 3 4 5 6 Schema 42
50 Secondo quanto visto in precedenza, la riduzione risulta completamente stereoselettiva grazie alla presenza dell’ossidrile libero in β al carbonile e disposto in posizione assiale, che è in grado di coordinare il riducente e dare trasferimento interno di idruro dallo stesso lato. L’analisi dello spettro 13C NMR evidenzia la scomparsa del segnale relativo al C=O a δ 204.6, mentre nello spettro protonico si evidenzia la comparsa di un doppietto a δ 3.19 identificativo del protone legato all’ossigeno in posizione 1.
2.4.7. Verso la sintesi di un mimico della struttura semplificata del polisaccaride capsulare dello Streptococcus pneumoniae 19F
Il composto 101 presenta gruppi protettivi ortogonali (in particolare allile e naftilmetile) che permettono di differenziare nettamente le due coppie di dioli cis (2,3 e 4,5). A questo punto lo schema sintetico prevede infatti la deprotezione selettiva dell’ossidrile in posizione 2 per trattamento con PdCl2 in una soluzione di MeOH-EtOH 1:1. Il
meccanismo implica una iniziale isomerizzazione del gruppo allilico e successiva idrolisi dell’emiacetale risultante, con conseguente liberazione della funzionalità ossidrilica. L’evolvere della reazione viene controllato tramite TLC (AcOEt-MeOH 9:1) ed una volta conclusa si filtra la sospensione per eliminare il reagente in eccesso e si purifica il grezzo per flash cromatografia nelle medesime condizioni utilizzate per l’analisi TLC; si recupera il prodotto puro con una resa del 76% (Schema 43).
O H MeO OH ONap O H O H MeO OH ONap Schema 43 101 116 HO 1 2 3 4 5 6 OAll HO 1 2 3 4 5 6 PdCl2 MeOH/EtOH
51 Il composto 116 viene trattato con DMP e TsOH (10%) nelle condizioni classiche per formare l’acetonuro sulle posizioni 2 e 3, le uniche con la corretta orientazione, ed una volta terminata la reazione si aggiunge alla miscela una quantità catalitica di AcOH glaciale, con lo scopo di deproteggere i restanti ossidrili dalla formazione dei derivati metossi-isopropilici (MIP) 117 che, in questo caso, possono generarsi nella miscela di reazione. Il gruppo MIP essendo un acetale misto ed aciclico risulta essere particolarmente labile e rimovibile senza intaccare minimamente il prodotto desiderato
118 che viene purificato per flash cromatografia ed ottenuto con una resa dell’ 89% (Schema 44). O H MeO O ONap O O H MeO OH ONap O H O O MeO O ONap O OMe MeO Schema 44 116 118 HO 1 2 3 4 5 6 HO 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 117 DMP TsOH Trattamento acido debole +
Il composto 118 viene sottoposto a benzilazione esauriente per trattamento con BnBr ed NaH in DMF a 0 °C e porta alla formazione del derivato dibenzilato 119; in seguito, utilizzando AcOH 80% a 80 °C si procede alla rimozione del ponte isopropilidenico. Il grezzo viene coevaporato con toluene e sottoposto a purificazione flash cromatografica, ottenendo 120 con una resa complessiva del 78% su due passaggi (Schema 45).
52 O H MeO O ONap O MeO O ONap O BnO MeO OH ONap O H BnO 119 118 HO BnO 120 BnO Schema 45
Il gruppo ossidrilico equatoriale viene benzilato selettivamente utilizzando la procedura dello stanniliden acetale: Bu2SnO in toluene a riflusso in condizioni di rimozione
azeotropica dell’ acqua; una volta formato l’acetale si aggiunge alla miscela di reazione BnBr e Bu4NBr e si lascia reagire a riflusso fino a scomparsa del prodotto di partenza
(TLC esano-AcOEt 2:8). Il grezzo viene purificato ottenendo 121 con una resa del 95%
(Schema 46). MeO OH ONap O H BnO MeO O ONap O BnO Sn Bu Bu MeO OH ONap BnO BnO 120 BnO BnO 121 BnO Schema 46
Sulla posizione 2 dell’α-L-ramnopiranosio dell’unità ripetitiva del polisaccaride capsulare dello Streptococcus pneumoniae 19F che il nostro analogo di sintesi dovrebbe andare a mimare non è presente la funzionalità ossidrilica libera che invece troviamo nel composto
121 ma una struttura disaccaridica; con lo scopo di semplificare al massimo la struttura ed
in analogia con i composti studiati per via computazionale, si è scelto di proteggere l’ossidrile come metil etere. Il composto 121 è stato solubilizzato in DMF e trattato con NaH e CH3I. Una volta terminata la reazione si aggiunge MeOH per distruggere il
reattivo non reagito e si estrae con AcOEt. La successiva purificazione del grezzo porta all’ottenimento del composto 122 puro con una resa del 95% (Schema 47).
53 MeO OH ONap BnO BnO MeO ONap BnO BnO OMe 121 BnO 122 BnO Schema 47
La rimozione del gruppo naftilmetilico viene effettuata disciogliendo il composto in una miscela di CH3CN-H2O 9:1 raffreddata a 0 °C a cui si aggiunge DDQ. Dopo il
trattamento ed il processo cromatografico si ottiene il derivato 123 come sciroppo incolore con una resa dell’80% (Schema 48).
La conferma della struttura è data dall’interpretazione degli spettri NMR in cui si può notare la scomparsa dei segnali relativi al gruppo protettivo (δ 4.82 e 4.68) e la comparsa di un doppietto a δ 3.44, indicativo della presenza del gruppo ossidrilico libero. MeO ONap BnO BnO OMe MeO OH BnO BnO OMe MeO OH BnO BnO OMe 122 BnO 123 BnO BnO Schema 48
Gli ultimi due step della sequenza prevedrebbero la fosforilazione sulla posizione ossidrilica libera e la successiva idrogenazione catalitica per eliminare i gruppi benzilici e formare così il mimico della struttura semplificata del polisaccaride capsulare dello
54 MeO O BnO OMe P O OMe OBn MeO O O H OMe P O O OMe MeO OH BnO OMe Schema 49 123 BnO BnO HO HO -BnO BnO 124 125
Una volta sintetizzato il prodotto deprotetto 125 sarà verificata la corrispondenza tra i dati sperimentali e quelli ottenuti per via computazionale, in modo tale da chiarire l’interscambiabilità tra l’α-L-ramnopiranosio ed il D-pinitolo.
55
2.5. Conclusioni
Prima sezione
È stata messa a punto una nuova via d’accesso a derivati 1,5-dicarbonilici della serie L -ribo migliore di quella riportata in letteratura a partire dal metil β-D-galattopiranoside e dal lattosio. Inoltre, come punto conclusivo dello studio della condensazione aldolica intramolecolare di aldoesos-5-ulosi, ne è stato verificato l’andamento stereochimico generale ed è stato confermato il modello proposto. Le riduzioni complementari dell’inosone ottenuto hanno permesso la sintesi di derivati del cis- e dell’epi-inositolo.
Seconda sezione
La strategia precedente è stata applicata nella sintesi di derivati del D-pinitolo selettivamente protetti. L’obbiettivo è stato quello di preparare un mimico della struttura semplificata del polisaccaride capsulare dello Streptococcus Pneumoniae 19F nell’ambito di uno studio mirato a comprendere l’interscambiabilità tra zuccheri ed inositoli.
In particolare è stata sfruttata la possibilità di introdurre gruppi protettivi ortogonali sullo zucchero di partenza, che ha permesso poi la manipolazione selettiva delle funzionalità ossidriliche secondarie degli inositoli, altrimenti difficilmente differenziabili tra loro.
