16 Il controllo della traduzione nello sviluppo e nel dierenziamento

Indice

Riassunto i

Abstract iii

Introduzione 1

Generare la diversità cellulare . . . . 2

Sviluppo della retina nei Vertebrati . . . . 2

Neurulazione e specicazione del campo dell'occhio . . . . 2

Struttura della retina neurale . . . . 3

I processi di dierenziamento nella retina neurale . . . . 6

Il problema del timing retinogenetico . . . 16

Il controllo della traduzione nello sviluppo e nel dierenziamento . 20 I processi di controllo della traduzione . . . 20

microRNA . . . 21

Proteine che regolano la traduzione legando l'RNA (RBP) . . 21

Controllo della traduzione: aspetti funzionali . . . 24

Scopo della tesi . . . 29

Il gene eterocronico lin-28 . . . 30

Nrp-1, l'omologo di Musashi in Xenopus . . . 34

1

Materiali e metodi 37

Tecniche di biologia molecolare . . . 39

Costrutti . . . 39

Metodi bioinformatici . . . 40

Embrioni di Xenopus laevis . . . 42

Fecondazione in vitro . . . 42

Fissazione e disidratazione . . . 43

Preparazione di sezioni istologiche . . . 45

Tecniche di rivelazione dell'RNA messaggero . . . 45

Sintesi di sonde a RNA . . . 45

Ibridazione in situ su sezioni . . . 46

Ibridazione in situ whole mount . . . 50

Lipofezione di vescicole ottiche di Xenopus laevis . . . 53

Iniezione della BrdU in embrioni lipofettati . . . 55

Immunoistochimica . . . 55

Anticorpi utilizzati . . . 57

Trattamento statistico dei dati . . . 58

Fotograe . . . 59

Risultati 60 Prima parte 62 Analisi dell'espressione di Xlin-28A e Xlin-28B . . . 63

Prolo di espressione di Xlin-28A . . . 63

Prolo di espressione di Xlin-28B . . . 65

Analisi funzionale di Xlin-28A . . . 68

Sovraespressione di Xlin-28A in progenitori retinici . . . 68 Dierenziamento di coni e bastoncelli dopo sovraespressione

di Xlin-28A . . . 70 Birthdating dei neuroni retinici dopo sovraespressione di

Xlin-28A . . . 72 Traduzione di Xotx2 dopo sovraespressione di Xlin-28A . . . 76

Seconda parte 76

RBP nella retina di Xenopus: Nrp-1 , Xpumilio e Xcat2 . . . 79 Analisi dell'espressione di Xpumilio e Xcat2 . . . 79 Analisi dell'espressione di Nrp-1 . . . 81 Ricerca in silico di motivi regolatori nel 3'UTR di Xotx2 ,

Xotx5b e Xvsx1 . . . 85 Analisi funzionale di Nrp-1 . . . 85 Sovraespressione di Nrp-1 in progenitori retinici . . . 86 Dierenziamento di coni e bastoncelli dopo sovraespressione

di Nrp-1 . . . 87 Birthdating dei neuroni retinici dopo sovraespressione di Nrp-1 89

Discussione dei risultati 91

Xlin-28 come candidato per la regolazione del timing retinogenetico . . . 96 Possibile ruolo di Nrp-1 nella retinogenesi . . . 99

Bibliograa 103