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View of Raised levels of circulating endothelial cells in systemic sclerosis

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Academic year: 2021

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INTRODUZIONE

L a sclerosi sistemica (SSc) è una patologia au- toimmune sistemica caratterizzata da una va- sculopatia per lo più del microcircolo e da iper- produzione di collagene e di altre componenti del- la matrice connettivale con deposizione a carico della cute e di organi interni (1-3). Sebbene il mec- canismo iniziale responsabile della malattia non sia ancora stato chiarito, si ritiene che il danno va- scolare rappresenti un elemento chiave nella pato- genesi della malattia sclerodermia (4, 5). È ipotiz- zabile che il ripetuto danno endoteliale indotto dall’ischemia e riperfusione conduca ad un’altera-

zione funzionale e ad una perdita irreversibile dell’integrità vasale con distacco cellulare, apoptosi necrosi e conseguente sofferenza tissutale. Sebbe- ne un’ampia letteratura sottolinei sulla base dei da- ti clinici e anatomo-patologici l’importanza pato- genetica della vasculopatia sclerodermica (6), la ricerca in questo campo risulta notevolmente limi- tata dalla inaccessibilità dell’endotelio scleroder- mico. Recentemente diversi studi hanno messo in evidenza l’importanza delle cellule endoteliali cir- colanti (CEC) quale utile marker in vivo di danno vascolare. Nell’uomo le CEC sono state descritte in diverse patologie accomunate dal danno endo- teliale quali le sindromi coronariche acute, le infe- zioni da Rickettsia conorii o Citomegalovirus, l’anemia falciforme, la porpora trombotica trom- bocitopenica, la malattia di Behçet, il lupus erite- matoso sistemico e le vasculiti (7-15).

In tutti questi disordini vascolari le CEC costitui- scono verosimilmente un’evidenza diretta della le- sione endoteliale nonché possono offrire materia- le interessante per studiare ex vivo le caratteristiche LAVORO ORIGINALE

Reumatismo, 2005; 57(1):29-35

Indirizzo per la corrispondenza:

Dott.ssa Nicoletta Del Papa Dip. Reumatologia, Ospedale G. Pini Via Pini, 9

20122 Milano

E-mail: delpapa@gpini.it

Reumatismo, 2005; 57(1):29-35

SUMMARY

Objective: Circulating endothelial cells (CECs) have been described in different conditions with vascular injury. Vas- cular abnormalities play a key role in the pathogenesis of Systemic Sclerosis (SSc). The aim of our study was to look for the presence of CECs in SSc patients and to evaluate their clinical significance.

Methods: We studied 52 SSc patients and 40 healthy controls (HC). Five-parameter, 3-color flow cytometry was per- formed with a FACScan. CECs were defined as CD45 negative, CD31 and P1H12 positive, and activated CECs as CD45 negative and P1H12, CD62, or CD106 positive. Results: Total and activated CEC counts were significantly higher in SSc patients when compared with HC and positively correlated with disease activity score. We found a sig- nificant association between CECs and disease activity; as regard with organ involvement, CEC number correlate with the severity of pulmonary hypertension.

Conclusions: Raised counts of CECs may represent direct evidence of active vascular disease in SSc as regard as vis- ceral involvement, the association between CECs and pulmonary hypertension suggest a relevant role for CECs as a marker of prominent endothelial involvement.

Cellule endoteliali circolanti quale marker diretto di danno endoteliale in corso di sclerosi sistemica*

Raised levels of circulating endothelial cells in systemic sclerosis

N. Del Papa 1 , M. Cortiana 2 , W. Maglione 1 , D.P. Comina 1 , I. Silvestris 2 , L. Moronetti Mazzeo 2 , N. Fracchiolla 2 , F. Fantini 1 , A. Cortelezzi 2

1 Dip. Reumatologia, Ospedale G. Pini, Milano;

2 Dip. di Ematologia, IRCCS Policlinico, Università di Milano

*Lavoro premiato al XL Congresso SIR, Udine 2003.

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fenotipiche e/o funzionali dell’endotelio danneg- giato.

Scopo di questo studio è stato quello di valutare mediante un’analisi citofluorimetrica se nel san- gue periferico di pazienti con SSc sono presenti CEC e quale sia il loro fenotipo. Abbiamo inoltre studiato se la presenza delle CEC in corso di SSc si correli all’attività di malattia, alle caratteristiche cliniche e/o a parametri plasmatici di danno endo- teliale.

MATERIALI E METODI

Pazienti

Sono stati studiati 52 pazienti affetti da SSc, 49 donne e 3 uomini, età mediana 58 anni (range 24- 71 anni). La diagnosi di SSc era stata posta sulla base dei criteri classificativi per la SSc proposti dall’American College of Rheumatology (17). In base alla classificazione di Le Roy (18), i pazienti sono stati suddivisi in due gruppi, 26 pazienti con SSc variante limitata (lcSSc) e 26 pazienti con SSc variante diffusa (dcSSc). La valutazione dell’atti- vità di malattia è stata fatta utilizzando i criteri di Valentini (19). L’interessamento d’organo è stato fatto come precedentemente riportato (17). Tutti i pazienti erano in terapia con calcio-antagonisti e/o ACE-inibitori. 25 pazienti erano in terapia con pro- staciclina sintetica; in questo caso, il campione per la ricerca delle CEC veniva prelevato almeno a di- stanza di 1 mese dall’ultima infusione. Sono stati esclusi dallo studio pazienti in terapia immuno- soppressiva.

Il gruppo di controllo era rappresentato da 40 sog- getti sani, paragonabili come età e sesso al gruppo patologico.

Determinazione delle CEC mediante analisi al citofluorimetro

100 µL di sangue periferico in Eparina sodica so- no stati incubati con 10 µL di un pannello di anti- corpi monoclonali (anti-CD45, -CD31, -CD106, - CD62 e P1H12) marcati con fluorescina isotiocia- nato (FITC), R-phicoeritrina (PE) o peridinin ch- lorophyll protein (PerCP), per 20 minuti a tempe- ratura ambiente (RT). I globuli rossi sono stati quindi lisati mediante incubazione in una soluzio- ne FACS lisante (Becton Dickinson, San Jose,CA) per 10 min a temperatura ambiente. Il pellet di glo- buli bianchi è stato poi lavato due volte con una so- luzione di FACS flow (Becton Dickinson). Sono state usate appropriate finestre di analisi per con-

tare il numero totale di CEC, nonché il numero di CEC attivate. Le CEC sono state definite come CD45 negative, CD31+ e P1H12+. Le CEC attiva- te sono state definite come P1H12+, CD62+ e/o CD106+. La lettura al citofluorimetro FACS con 15-mW argon laser (excitation a 488 mm) (Becton Dickinson) è stata seguita a tre colori/cinque para- metri. La sensibilità dei determinanti di fluore- scenza è stata settata e monitorata usando Calibri- te Beats (Becton Dickinson) secondo le indicazio- ni della ditta produttrice. Cellule colorate con IgG1 isotipic controls marcate con FITC o PE sono sta- te usate come controllo negativo. Sono state ac- quisite almeno 100.000 cellule per campione: le analisi sono state considerate informative quando un adeguato numero di eventi (>100) è stato ac- quisito nelle finestre di valutazione delle CEC. I da- ti sono stati analizzati mediante CELLquest softwa- re (Becton Dickinson).

Dosaggio plasmatico di SE-Selectina e IL6 I livelli plasmatici di E-selectina solubile e IL6 so- no stati determinati mediante metodica ELISA (enzyme-lynked immunsorbent assay; R&D Sy- stem, Mineapolis, MN) e calcolati mediante l’uso di una curva di riferimento standard, secondo le indicazioni della ditta.

Analisi statistica

Sono stati messi a confronto i valori di CEC dei sie- ri dei pazienti sclerodermici con quelli dei controlli sani mediante il test di Mann-Whitney. È stato con- siderato significativo un valore di P <0.05. Inoltre, le correlazioni tra il numero di CEC ed i differen- ti parametri clinici e strumentali di patologia scle- rodermica sono state studiate mediante il test di correlazione di Spearman.

RISULTATI

Caratteristiche cliniche dei pazienti

I pazienti, tutte donne, avevano un’età media di 53

anni (range compreso tra 24 e 72 anni). 26 pazien-

ti erano affetti da lcSSc e 26 da dcSSc. La durata

media di malattia era di 5.5 anni (range 1-23). Tut-

ti i pazienti riferivano fenomeno di Raynaud

all’esposizione a basse temperature. Le ulcere cu-

tanee sono state riscontrate in 17 pazienti su 52

(32.6%). Riguardo al coinvolgimento polmonare

12 pazienti su 52 (23,9%) avevano fibrosi con iper-

tensione polmonare e 16 su 52 (30.4%) avevano

ipertensione polmonare primitiva. La valutazione

(3)

dell’attività di malattia secondo i criteri del Grup- po Europeo di Sclerodermia indicava che 28 pa- zienti su 52 avevano una malattia attiva.

Determinazione quantitativa delle CEC

Le CEC sono state identificate come negative per il marker ematopoietico CD45 e positive per il CD31 e per il marcatore endoteliale specifico (P1H12) (Fig. 1). Il numero medio di CEC nei pa- zienti sclerodermici è risultato 317/mL (95% CI 243-375) e significativamente più alto rispetto ai controlli sani 77/mL(95% CI 69-110; P < 0.00001).

Analizzando i subset di malattia, sia i pazienti con lcSSc che i pazienti con dcSSc mostrano livelli si- gnificativamente aumentati di CEC rispetto ai con- trolli sani (rispettivamente P < 0.05 e P < 0.001) (Fig. 2). I pazienti con dcSSc avevano un maggior numero di CEC rispetto ai pazienti con lcSSc, ma la differenza non era statisticamente significativa (valore medio 376 cell/mL e 236 cell/mL).

Le CEC mostravano una forte correlazione con l’attività di malattia (r S = 0.728, P = 0.001) (Fg. 3).

Non è stata trovata alcuna correlazione tra i livelli di CEC e le ulcere digitali, i parametri cutanei (i.e.

skin score totale e sclerodermia) e il coinvolgi-

mento articolare o muscolare. Per quanto riguarda il coinvolgimento polmonare le CEC mostravano una correlazione significativa con i valori di pres- sione arteriosa polmonare in tutti i pazienti sclero- dermici (r s = 0.379, P < 0.05) (Fig. 4) e nella for- ma limitata (rs = 0.515, P < 0.05). Inoltre è stato evidenziato un rapporto inversamente proporzio- nale tra il numero di CEC e DLCO (capacità vita- le e diffusione alveolare) unicamente nella lcSSc (r s

= 0.416, P < 0.005). Non è stata osservata nessu- na correlazione significativa tra livelli di CEC e le concomitanti terapie in atto.

Fenotipo delle CEC

Per valutare se le CEC presentano un fenotipo at- tivato, abbiamo valutato l’espressione del P1H12 e delle molecole espresse sulla superficie dell’endo- telio attivato (Fig. 1). Il numero delle CEC che esprimevano sE-selectina o VCAM-1 (rispettiva- mente CD62 e CD106) risultavano marcatamente aumentate in pazienti sclerodermici rispetto ai con- trolli sani (rispettivamente P = 0.01 e P = 0.001) Fig. 5), rappresentando il 20% del totale delle CEC.

Il numero e il fenotipo delle CEC attivate non va- riava nei differenti sottotipi di malattia. È stato os- Figura 1 - Valutazione cito-

fluorimetrica delle cellule en- doteliali circolanti (CEC). a) Pannello di analisi che evi- denzia le finestre di analisi uti- lizzate per escludere le piastri- ne e i detriti cellulari. b) Pan- nello di analisi che mostra il controllo negativo, le CEC to- tali e le CEC attivate. PerCP = peridin chlorophyll protein; PE

= phycoerythrin; FITC = fluo-

rescin isiothiocyanate.

(4)

servato un numero più elevato di CEC in pazienti con malattia attiva (pazienti con score di attività di malattia >3) rispetto a pazienti in buon controllo clinico; analogamente, si è evidenziata una corre- lazione significativa tra il numero di CEC attivate e score di attività di malattia (r s = 0.375, P = 0.005).

Livelli plasmatici di marcatori di danno endoteliale Sia i livelli plasmatici di sE-selectina che di IL6 ri- sultavano significativamente elevati nei pazienti sclerodermici rispetto ai controlli sani, rispettiva- mente sE-selectina 42.30 ± 23.7 ng/mL nei pazienti sclerodermici e 8.8 ± 8.7 nei pazienti sani (P

<0.0001) e IL 6 98 pg/mL nei pazienti scleroder-

mici e 31.3 pg/mL nei pazienti sani (P = 0.01) In particolare i parametri di sE-selectina mostravano una correlazione con i livelli di CEC totali e atti- vate (rispettivamente rs = 0.594, P < 0.01) (Fig. 6).

I livelli di IL 6 appaiono aumentati nei pazienti sclerodermici rispetto ai sani, ma non c’è correla- zione con la quantità di CEC.

DISCUSSIONE

Lo scopo del nostro studio è stato quello di valu- tare se nel sangue periferico di pazienti con SSc so- no evidenziabili CEC e di valutarne la correlazio-

1000

800

600

400

200

0

HC ISSc dSSc

C EC s (c el ls /m L b lo o d )

P = 0.05

P = 0.001

Figura 2 - Correlazione tra il numero di cellule endoteliali circolan- ti nei pazienti sani e nei due sottogruppi di sclerodermia, limitata e diffusa.

1000

800

600

400

200

0

Activity score r s = 0.728 p = 0.001

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

C E C s (c e ll s/ m L b lo o d )

Figura 3 - Correlazione tra il numero di cellule endoteliali circolan- ti e l’attività di malattia.

Pressione polmonare (mmHg)

0 20 40 60 80 100

1000

800

600

400

200

0

N u m er o d i C EC /m L

P < 0.05 r 3 = 0.379

Figura 4 - Correlazione tra i livelli di cellule endoteliali circolanti e i valori di pressione polmonare artereriosa nei pazienti scleroder- mici.

300

200

100

0

C EC s (c el ls /m L b lo o d )

CD106

HC SSc

CD62

HC SSc

P = 0.01 P = 0.01

Figura 5 - Correlazione tra il numero di cellule endoteliali attivate

(CD62) e totali (CD106) nei soggetti sani e nei pazienti sclerodermici.

(5)

ne con i differenti sottotipi e stadi di malattia. I ri- sultati dello studio mostrano che i pazienti con SSc hanno alti livelli di CEC sia totali che attivate; inol- tre, la presenza ed il numero di CEC correla con l’attività di malattia e, per quanto riguarda il coin- volgimento d’organo, con la presenza di iperten- sione polmonare.

La determinazione delle CEC nel sangue periferi- co è stata di recente proposta come parametro at- tendibile di danno endoteliale in differenti patolo- gie vascolari, quali la sindrome coronaria acuta, l’anemia falciforme, la porpora trombotica trom- bocitopenica, le infezioni da Rickettsia e da Cito- megalovirus, la malattia di Behcet, il Lupus Erite- matoso Sistemico e le vasculiti dei piccoli vasi AN- CA-correlate. Analogamente a tali patologie, anche la SSc è una patologia fortemente caratterizzata da una microangiopatia come evidenziato dal riscon- tro istologico di anomalie del microcircolo a livel- lo del derma, caratterizzate dalla perdita delle giun- zioni intercellulari e da aspetti di sofferenza (fino alla morte) delle cellule endoteliali. Pertanto il ri- scontro delle CEC in corso di SSc costituisce un’ul- teriore conferma del ruolo chiave svolto dall’en- dotelio nella patogenesi della malattia. È quindi le- cito pensare che qualunque sia il meccanismo pa- togenetico responsabile del danno del microcirco- lo, il ripetersi della sofferenza endoteliale può con- durre alla irreversibile perdita di integrità con di- stacco, apoptosi e necrosi delle cellule endoteliali.

Il numero di CEC riscontrate in pazienti sclero- dermici non differisce nei diversi sottotipi di ma-

lattia. Tale dato è ulteriormente supportato dal fat- to che diversi studi hanno dimostrato che sia nella forma limitata che in quella diffusa sono presenti elementi istologici di danno vascolare sia nei tes- suti danneggiati che in quelli apparentemente sani (21-23). Inoltre il numero di CEC riscontrate nel- la SSc è paragonabile a quello rilevato in pazienti affetti da altre patologie caratterizzate da un este- so danno vascolare, quali l’anemia a cellule fal- ciformi, le infezioni di Rickettsia e da Cytomega- lovirus e le vasculiti ANCA associate (9-10-12, 15).

I marcatori di attivazione e di danno endoteliale, quali le molecole di adesione solubili (sVCAM ed sE-selectina) sono stati presi in considerazione qua- li possibili parametri per valutare l’attività e la se- verità della malattia sclerodermica (24). I nostri ri- sultati mostrano che in corso di SSc il numero del- le CEC è strettamente correlato con l’attività di malattia, suggerendo che queste cellule possano essere considerate un marcatore addizionale di at- tività di malattia nei pazienti sclerodermici. Tali dati sono ulteriormente avvalorati dal fatto che l’at- tività di malattia è stata valutata applicando un me- todo validato (19). Tutti gli studi precedenti defi- nivano invece l’attività di malattia in maniera as- solutamente “empirica” e personale, e comunque non validata, considerando attivi quei pazienti che avevano una rapida progressione di malattia o mo- stravano una alterazione degli indici di flogosi (20).

Riguardo al coinvolgimento d’organo, è stata ri- scontrata una netta correlazione tra livelli di CEC e ipertensione polmonare nel complesso delle SSc e in particolare nel sottogruppo delle lcSSc. In que- st’ultimo sottogruppo di pazienti si è riscontrata un’associazione tra i livelli di CEC e la compro- missione della DLCO. Questi risultati sono ben comprensibili se si considera che i meccanismi re- sponsabili dell’ipertensione polmonare nella lSSc sono profondamente differenti rispetto a quelli ef- fettivi nell’ipertensione polmonare della forma dif- fusa di malattia. Diversi studi hanno ampiamente dimostrato che l’endotelio danneggiato sia dal pun- to di vista funzionale che strutturale ha un ruolo cri- tico nell’insorgenza e nella progressione dell’iper- tensione polmonare della SSc. Le conseguenze del persistente danno endoteliale includono il vaso- spasmo, il rimodellamento vascolare e la trombo- si, a loro volta responsabili sia dell’incremento del- le resistenze vascolari polmonari sia dell’alterato rapporto ventilazione/perfusione. Tali meccanismi che possono essere attribuiti ad una malattia pol- monare puramente endoteliale, sono particolar-

sE-selectin (ng/mL)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 600

500

400

300

200

100

0

C EC s (c el ls /m L b lo o d )

r s = 0.594 p < 0.01

Figura 6 - Correlazione tra il numero di cellule endoteliali e la con-

centrazione di livelli citoplasmatici di sE-selectina.

(6)

mente attivi in pazienti con lcSSc. Tali pazienti hanno un rischio maggiore di sviluppare una pro- gressiva ipertensione polmonare in assenza di al- terazioni fibrotiche interstiziali; al contrario, in pa- zienti affetti da dcSSc lo sviluppo di ipertensione polmonare è solitamente tardivo e dovuto princi- palmente a fibrosi polmonare risultato finale di un alveolite polmonare evoluta.

Il riscontro di un numero elevato di CEC con fe- notipo pro-adesivo conferma i dati noti dalla lette- ratura che le cellule endoteliali possono essere pre- senti in forma attivata nei piccoli vasi di pazienti SSc (21, 25-28). Molti studi hanno infatti dimo- strato che in questi pazienti vi è un’aumentata espressione di molecole di adesione come sE-se- lectina, ICAM-1 e VCAM-1 a livello cutaneo, non- ché un aumento delle concentrazioni plasmatiche delle forme solubili delle delle molecole di ade- sione come sE-selectina, ICAM-1 e VCAM-1. La sE-selectina è la molecola di adesione altamente specifica per le cellule endoteliali; i suoi elevati li- velli plasmatici e l’aumentata espressione nei tes-

suti sclerodermici sembrano essere strettamente correlati all’attivazione endoteliale. Nel nostro stu- dio ciò è confermato dal riscontro nei pazienti con SSc di livelli plasmatici significativamente elevati di sE-selectina. Inoltre, tali livelli correlano stret- tamente con il numero totale di CEC. Sulla base di tali osservazioni, le CEC attivate possono essere considerate un parametro importante per la valuta- zione endoteliale in vivo.

In conclusione, i nostri dati evidenziano la presen- za in pazienti sclerodermici di un numero rilevante di cellule endoteliali mature circolanti come possi- bile risultato del distacco dalle pareti vasali dan- neggiate. La stretta correlazione fra l’attività di ma- lattia e il numero delle CEC suggerisce che queste ultime possono essere considerate un marker pro- mettente di danno vascolare e di progressione della malattia, con particolare riguardo allo sviluppo di ipertensione polmonare in pazienti con lcSSc. Inol- tre, la possibilità di individuare precocemente pa- zienti con patologia vascolare attiva potrebbe esse- re utile per monitorare l’efficacia di tali trattamenti.

RIASSUNTO

Studi recenti hanno evidenziato la presenza di cellule endoteliali circolanti (CEC) in diverse patologie accomunate da un danno vascolare. La Sclerosi Sistemica (SSc) è primariamente caratterizzata importanti elementi di sofferenza va- scolare. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare se nel sangue periferico di pazienti con SSc sono presen- ti CEC e di valutarne il loro significato clinico.

Materiali e Metodi: Sono stati studiati mediante analisi citofluorimetrica i campioni di sangue periferico di 52 pazienti con SSc e 40 soggetti sani (HC). Le CEC sono state identificate come CD45 negative, CD31 e P1H12 positive, e le CEC attivate come CD45 negative eP1H12, CD62, or CD106 positive.

Risultati: Il numero di CEC totali e attivate era significativamente più alto nei pazienti con SSc rispetto ai controlli sa- ni. Inoltre è stata riscontrata una associazione significativa tra il numero delle CEC e l’attività di malattia. Relativa- mente all’interessamento d’organo, le CEC correlavano significativamente con l’ipertensione polmonare

Conclusioni: L’elevato numero di CEC riscontrato in corso di SSc attiva costituisce un’ulteriore evidenza del danno vascolare caratteristico di questa patologia. Tali dati suggeriscono inoltre che le CEC potrebbero essere utilizzate in futuro come marker di malattia attiva nonché nel monitoraggio della progressione della patologia.

Parole chiave - Cellule endoteliali, sclerosi sistemica, ipertensione polmonare.

Key words - Endothelial cells, systemic sclerosis, pulmonary hypertension.

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