Materiali e Metodi
insieme ad un marcatore di lunghezza in paia di basi. Se la reazione è avvenuta correttamente ed è stato amplificato un frammento della lunghezza attesa, si eluisce da gel il DNA ottenuto.
Questo protocollo è stato utilizzato per ottenere frammenti da clonare in opportuni vettori per generare alcuni dei costrutti utilizzati nel presente lavoro di tesi.
2.4.a Generazione dei costrutti deleti
L’uso di questa procedura ha permesso di eliminare porzioni progressivamente crescenti della porzione 3’ dei geni wild-type.
Per prima cosa sono stati disegnati degli oligonucleotidi che fossero in parte complementari alla sequenza del DNA, ma che al loro interno contenessero una sequenza di taglio riconosciuta dall’enzima EcoRI: GAATTC.
Dopodiché si effettua la PCR secondo questo protocollo:
DNA 20 ng
RedTaq Polimerasi 2,5 µl
Reaction Buffer 1/10 volume finale
Primer 5’ 125 ng
Primer 3’ 125 ng
Mix deossinucleotidi 250 µM ognuno
H20 mq fino a volume di 100 µl
Materiali e Metodi
Cicli:
I ciclo (1x) 94°C per 3 minuti (permette la lisi cellulare ed il rilascio di DNA in soluzione)
II ciclo (3x) 94°C per 30 secondi 55°C per 30 secondi 72°C per 1 minuto II ciclo (32x) 94°C per 30 secondi 65°C per 30 secondi 72°C per 1 minuto III ciclo (1x) 72°C per 3 minuti
Successivamente si digerisce con EcoRI, si eluisce da gel la banda e si effettua la ligation con il plasmide precedentemente linearizzato con EcoRI. Il prodotto della ligation viene usato per trasformare le cellule da cui poi si estrae il DNA che viene mandato a sequenziare.
