Sistema di controllo del calcio citosolico

Struttura di adenilato ciclasi e PKA, struttura delle fosfolipasi C, diversità tra le varie isoforme. I secondi messaggeri: cAMP e cGMP. Diacilglicerolo e IP3. Struttura, attivazione e funzione di Ras; vie di trasduzione delle MAP kinasi. Isoforme gamma delle fosfolipasi C. Inositolo trifosfato e depositi intracellulari di Calcio: recettori canale intracellulari. Calcio come secondo messaggero; calmodulina e CAM kinasi II.

(II)

Sistema di controllo del calcio citosolico

La concentrazione di calcio libero nel citosol è mantenuta al di sotto di 0.2 µM. Le PMCA (P lasma Membrane Calcium ATPase) e lo scambiatore Na- Ca pompano il calcio fuori dalla cellula.

L e S E R C A ( S a r c o - E n d o p l a s m i c

Reticulum Calcium ATPase) pompano il

calcio nel reticolo endoplasmico.

•  In opposizione ad altri secondi messaggeri, il calcio deve essere mantenuto a basse concentrazioni; una sua elevata concentrazione nelle cellule porta alla loro morte.

•  Il Ca

non viene generato a partire da un precursore

inattivo; ciò comporta che la sua concentrazione

all’interno della cellula deve essere finemente

regolata attraverso l’interazione con proteine in

grado di legarlo e di estruderlo al di fuori della cellula

o di segregarlo in compartimenti.

Tipi e funzioni dei canali del Ca

Vie di entrata del Ca

in risposta a segnali

L’aumento citosolico del Ca

è un fenomeno transiente perchè le

pompe per lo stesso ione, localizzate sulla membrana plasmatica e

sulla membrana del ER, trasportano attivamente gli ioni Ca

dal

citosol verso l’esterno della cellula e il lume del ER. Inoltre, nel giro

di pochi secondi IP3 viene idrolizzato a inositolo 1,4-bisfosfato,

molecola incapace di stimolare la liberazione del calcio.

In assenza di specifici meccanismi per rigenerare le scorte intracellulari

di ioni Ca

, una cellula perderebbe la capacità di far aumentare la

concentrazione citosolica di Ca

in risposta a uno stimolo ormonale. In

alcuni tipi cellulari sono stati identificati dei canali Ca

, detti store-

operated channels (SOCs) che si aprono in seguito a deplezione delle

scorte intracellulari di Ca

.

Non tutte le cellule rispondono allo stesso modo all’IP3 e ciò potrebbe essere legato alla presenza di differenti isoforme di proteine canale.

L’apertura dei canali del calcio è potenziata dal Ca

citosolico stesso

che fa aumentare l’affinità del recettore per l’IP3, con il risultato di

una maggior liberazione di calcio dal deposito. Elevate concentrazioni di

Ca

citosolico, però, inibiscono il rilascio dalle scorte intracellulari in

quanto fanno diminuire l’affinità del recettore per IP3.

Il recettore dell’IP3 è un recettore-canale per il calcio localizzato sulla membrana del reticolo endoplasmatico. Sia il dominio N- terminale sia il dominio C-terminale, entrambi rivolti verso il citosol, sono responsabili del legame con l’IP3 (a livello delle cariche positive degli aminoacidi lisina ed arginina). Una peculiarità del recettore per l’ IP3 è la simultanea sensibilità ad IP3 e al calcio.

Un segmento di circa 100 aminoacidi in prossimità della regione transmembrana costituisce il poro canale per il catione e sembra essere il sito di legame per il calcio stesso.

Il recettore dell’IP3

•  Mentre l'aumento citosolico di Ca²⁺ indotto da IP3 per ottenere una risposta cellulare richiede anche l’intervento di SOC, il rilascio di Ca²⁺ dal reticolo sarcoplasmico da solo è sufficiente a indurre la contrazione muscolare.

Analogamente alla proteina canale del reticolo endoplasmico, i recettori per la ryanodina, nel muscolo scheletrico, sono stimolati da un leggero aumento del calcio citosolico, ma al contrario, essi non vengono inibiti da elevate concentrazioni di Ca²⁺. La ripolarizzazione della membrana delle cellule muscolari provoca la chiusura dei canali RYR e li rende insensibili al calcio.

•  Nei neuroni i recettori RYR sono localizzati nelle membrane del reticolo endoplasmico. Non è chiaro come i canali del calcio si aprano in risposta ai neurotrasmettitori o a una modificazione del potenziale di membrana.

Recentemente è stato identificato una nuovo molecola segnale, l’ADP ribosio ciclico, in grado di promuovere il rilascio degli ioni Ca²⁺ dalle riserve neuronali attraverso la stimolazione dei recettori RYR.

•  Il controllo spaziale del rilascio degli ioni Ca²⁺ dai depositi intracellulari ha un ruolo importante. Ad esempio il rilassamento delle cellule muscolari lisce presenti nella parete delle arterie è la conseguenza del rilascio del calcio da regioni del reticolo sarcoplasmico situate di fronte alla membrana plasmatica.

Questo rilascio è mediato dai recettori RYR presenti nelle membrane SR e porta all' apertura di canali per gli ioni K+ nella membrana plasmatica: gli ioni K+ fuoriescono dalla cellula che si iperpolarizza. Questa iperpolarizzazione inibisce la contrazione Ca²⁺-dipendente. Per contro, il rilascio di calcio nel citoplasma delle cellule muscolari porta alla contrazione.

L’apertura dei canali recettori

Ryanodina libera Ca²⁺ dai depositi nel muscolo e nelle cellule nervose.

Nelle cellule muscolari e nei neuroni sono presenti dei canali cellulari detti recettori a ryanodina (RYR), a causa della loro sensibilità all’alcaloide

vegetale ryanodina. Nelle cellule del muscolo scheletrico questi recettori sono localizzati nelle membrane del reticolo sarcoplasmico (SR) e sono associati al dominio citoplasmatico dei recettori per la diidropiridina.

Quest’ultimo è localizzato sulla

membrana plasmatica ed è sensibile a differenze di voltaggio. Un

cambiamento del potenziale di

membrana induce una modificazione conformazionale nel recettore a diidropiridina, questa, a sua volta, induce delle modificazioni nel

recettore RYR e l’apertura del canale.

Il canale RYR

Il canale per il calcio RYR può essere considerato come una proteina “scaffold” in quanto recluta su di esso molte altre proteine, tra cui chinasi e

fosfatasi che ne regolano lo stato di fosforilazione e quindi l’attività

Citosol

Lume del RS

I recettori della rianodina(RyR) sono canali tetramerici localizzati sul reticolo sarcoplasmatico dei cardiomiociti, che rilasciano Ca²⁺

n e l c i t o s o l a t t r a v e r s o u n meccanismo detto ‘rilascio di Ca²⁺ - Ca²⁺-indotto’.

L’aumento dei livelli citosolici di Ca²⁺ consente l’avviamento del ciclo dei ponti trasversali a livello dei miofilamenti contrattili .

L’apertura dei RyR è dovuta al legame di ioni Ca²⁺ su specifici siti r e c e t t o r i a l i , i n s e g u i t o all’attivazione dei canali del calcio di tipo L.

L’attivazione può essere potenziata dalla fosforilazione mediante PKA e CamKII.

Regolazione dei recettori della rianodina (rilascio di Ca

-Ca

-

indotto)

Ruoli della proteina FBPK12 o calstabina

Ø A riposo stabilizza il canale nello stato chiuso

Ø Media l’interazione diretta tra DHPR1 e RYR (solo muscolo

scheletrico)

Ø Sincronizza l’apertura dei canali RYR

Ø Regola la sensitività del RYR verso il calcio.

La dissociazione di FBPK12 da RYR comporta l’apertura del canale ed influenza negativamente l’apertura e la chiusura sincrona dei vari canali RYR

Regolazione dell’apertura del canale RYR da parte della proteina FKBP12 o calstabina

FKBP12

PKA interagisce con i leucin Zipper di RYR (attraverso APAK) e fosforila RYR

al residuo di serina 2809. Ciò comporta un incremento della probabilità di

apertura del canale dovuto alla dissociazione della calstabina da RYR.

or IP₃

CaMK MLCK

NOS

Il Ca²⁺ lega varie proteine che sono in grado di attivare altre proteine o enzimi

Ø Il complesso Ca²⁺-calmodulina attiva la chinasi CAM che attiva la miosina chinasi nelle cellule

muscolari lisce e l’ossido nitrico sintetasi nelle pareti dei vasi sanguigni

Ø Il Ca²⁺ lega la troponina C

(correlata alla calmodulina) nelle cellule muscolari scheletriche permettendo l’interazione actina- miosina

Ø Il Ca²⁺ lega proteine coinvolte nella fusione di vescicole con la membrana cellulare, come in cellule secretorie e alla terminazioni

nervose.

1% delle proteine totali

Affinità per il Ca²⁺ 1000 volte > rispetto al Mg²⁺

I complessi Ca

/CaM si legano ad altre proteine variandone la loro attività funzionale

Forma estesa

Forma più compatta

Ca

/CaM legata

alla proteina bersaglio

Ca

Regolazione operata dal complesso Ca

-calmodulina

Ca²⁺-ATPAsi

Fosfodiesterasi

Fosforilasi chinasi (FosCh) Chinasi calmodulina dipendente III (CaMKIII)

Del fattore eucariotico di allungamento II

Adenilato-ciclasi

La CaM II fosforila

Sinapsina I nel tessuto nervoso Guanilato ciclasi

Fosforilazione proteine nucleari e Della membrana

Fosforilazione proteine del citoscheletro ( Disassemblaggio dei Microtubuli) Chinasi che fosforila catena leggera

della miosina (MLCK)

CaM chinasi multifunzionali Ia, Ib, II e IV

CaM chinasi specifiche

Fosfolipasi

Attivazione della chinasi CaM II

L'attivazione della chinasi CaM II può servire da traccia di memoria di un precedente impulso di Ca

a causa della proprietà di autofosforilazione La chinasi CaM

II é un esempio di chinasi CaM multifunzionale.

Attiva la tirosina idrossilasi e di

conseguenza la sintesi di catecolammine Fosforila la sinapsina I attivando

l’esocitosi dei neurotrasmettitori

Un esempio classico é la fosforilasi chinasi del muscolo scheletrico che può essere attivata sia dal complesso calcio-calmodulina che da PKA

A) Il calcio attiva la contrazione muscolare, libera le risorse enegetiche necessarie (glucosio da glicogeno) sia:

1)  attivando la fosforilasi chinasi

2) inibendo la glicogeno sintasi (mediante fosforilazione da parte della chinasi CaM);

B) L’AMPc, indotto da adrenalina, attiva la PKA che fosforila la fosforilasi chinasi, ciò prepara la cellula muscolare a una accresciuta domanda di energia, sensibilizzando la f o s f o r i l a s i c h i n a s i a b a s s e concentrazioni di calcio.

La via dell'AMP ciclico e del Ca

interagiscono

PKA Ca

Nei cardiomiociti, l’aumento dei livelli del Ca

citosolico attiva non solo la proteinchinasi Ca

/ calmodulina-dipendente di tipo II (CamKII), ma anche la

calcineurina (Cn), una serina- treonina proteinfosfatasi, anch’essa CaM-dipendente.

L’attivazione della Cn induce

ipertrofia cardiaca attraverso la defosforilazione di fattori di

trascrizione della famiglia NFAT (nuclear factor of activated T cells) che, nella forma

fosforilata, sono localizzati nel citosol, nello stato inattivo.

L’ attivazione della calcineurina opera la defosforilazione di NFAT citosolica e la sua traslocazione nucleare, che porta all’attivazione di geni legati al programma ipertrofico.

Ripristino dei valori basali di Ca

: recupero del Ca

nel reticolo

endoplasmatico

Ripristino dei valori basali di Ca

: recupero del Ca

nel reticolo endoplasmatico

SERCA2a, che rimuove normalmente più del 70% del Ca

citosolico, è regolata da una famiglia di proteine demominate fosfolambani (PLN).

Nella forma non fosforilata i PLN hanno effetto inibitorio su SERCA2a, ma in seguito a fosforilazione da PKA (stimolazione adrenergica) o da Ca2+/

CaMKi PLN si dissociano da SERCA2a, che in questo modo viene ulteriormente attivata.

Come risultato della fosforilazione dei PLN e dell’attivazione di SERCA2a la

velocità di rilassamento cardiaco viene aumentata. Inoltre, nei battiti

seguenti, la contrattilità aumenta in proporzione alla quantità di Ca

che è

stata precentemente immagazzinata nel reticolo endoplasmatico.

Regolazione di SERCA2a mediata dai fosfolambani

NO a livello del SN è considerato un trasmettitore non convenzionale:

Ø  E’ un gas; per tale ragione non può essere immagazzinato e la sua sintesi è finemente regolata

Ø  Non viene rilasciato per esocitosi

Ø  Manca di un processo attivo che pone fine alla sua azione (l’inattivazione è dovuta alla rapida emivita del NO (<30 s) o a reazione del NO con altri composti contenenti ferro)

Ø  Non interagisce con recettori presenti sulle cellule bersaglio

Ø  Regola le funzioni delle terminazioni assonali presinaptiche

del neurone in cui esso stesso è stato sintetizzato

Sintesi dell’ossido nitrico:

Ø  Conversione dell’arginina in NO e citrullina catalizzata da NO sintetasi (NOS)

4 distinte isoforme di NOS

Ø  iNOS presente nei macrofagi e nella microglia

Ø  eNOS presente nelle cellule endoteliali che rivestono i vasi

Ø  nNOS presente nei neuroni

Ø  mtNOS presente a livello mitocondriale

Ossido di azoto e cGMP

Stores

Intracellulari del Ca

Ca

NO

Arginina

Citrullina +

NO Sintetasi

Ca

Ca

CaM

cGMP

GTP NO

Guanilato Ciclasi Solubile

sGC

Canali ionici

Protein chinasi cGMP-Dipendente (PKG) PDE

GMP

GLU

•  Le guanilato ciclasi solubili, attivate dall’ossido nitrico (NO), sono degli eterodimeri che contengono una molecola di eme che

interagisce con entrambe le subunità.

•  cGMP media la via di trasduzione del segnale dell'ossido nitrico

Nature review 2002 3,713 Locally produced NO

5’-GMP

sGC

cGMP

PKG

IP3R

MLC MLC phosphatase

MLCK PDEs

Viagra

Ca2+

export

Ca2+

Ca2+

entry

CaM

MLCK

(inactive) (active)

MLCK P

Non-activatable)

MLC P

Contraction Actin

Il Viagra inibisce specificamente l’idrolisi del cGMP ad opera della fosfodiesterasi 5 (PDEs una isoforma localizzata nei tessuti erettili) e perciò prolunga e aumenta l’effetto del NO/

cGMP.