I canali al potassio ATP-sensibili sono distribuiti in molti organi e tessuti e vengono ritenuti importanti bersagli farmacologici in diverse patologie cardiovascolari come ischemia, diabete, patologie neurodegenerative come Parkinson e Alzheimer e altre patologie quali asma, sindrome della vescica iperattiva, disfunzione erettile, disturbi della prostata. Nei miocardiociti sono stati identificati due tipi di canali al potassio: quelli presenti sulla membrana del sarcolemma sarc-KATP e quelli situati sulla membrana interna
del mitocondrio mito-KATP. I canali al potassio ATP-sensibili mitocondriali e del
sarcolemma sono coinvolti nel meccanismo self-defense del precondizionamento ischemico. I canali al potassio mitocondriali mito-KATP sembrano avere un ruolo essenziale
nell’ IPC anche se non si può tuttavia escludere il coinvolgimento dei sarc-KATP.
L’IPC è un meccanismo endogeno in cui brevi periodi d’ischemia determinano un aumento della resistenza delle cellule cardiache al danno indotto da un successivo e più prolungato attacco ischemico, riducendo così l’estensione della necrosi cellulare. Questo fenomeno risulta essere attivato sia da processi recettore-dipendenti, in cui sono coinvolti mediatori endogeni come l’adenosina e la bradichinina, sia da processi recettore-indipendenti, mediati da NO e radicali liberi, che portano all’attivazione dei canali KATP.
L’attivazione di questi canali da parte di molecole esogene viene considerato come uno strumento promettente per produrre un precondizionamento farmacologico capace di riprodurre l’IPC endogena e di conferire alle cellule del miocardio una maggiore resistenza contro il danno ischemico.
La somministrazione di diazossido, attivatore dei canali KATP, induce un effetto protettivo
sul cuore a dosi che sono in grado di aprire il canale mitocondriale ma non quello del sarcolemma.
Inoltre la somministrazione dell’acido 5-idrossidecanoico (5-HD), bloccante selettivo dei canali mito-KATP, previene la protezione mediata dal diazossido contro l’IPC, confermando
così l’ipotesi che l’attivazione dei canali mito-KATP induce l’effetto cardioprotettivo. Molte altre classi di KCOs come derivati benzopiranici quali il cromakalim, tioformammidi come l’aprikalim e cianoguanidine come il pinacidil inducono un effetto cardioprotettivo attribuibile all’attivazione dei canali al potassio mitocondriali. Purtroppo tali effetti sono generalmente associati ad effetti sistemici indesiderati mediati dai canali sarc-KATP, quali, ad esempio la resistenza periferica e una marcata ipotensione che
rappresentano un limite insormontabile per il loro uso clinico nella protezione contro il danno ischemico.
Negli ultimi anni la ricerca si è indirizzata verso la sintesi di derivati dotati di maggiore selettività tissutale verso i canali mito-KATP con l’intento di ottenere molecole dotate di un
migliore profilo farmacologico.
In particolare i due derivati benzopiranil-cianoguanidinici BMS-180448 e BMS-191095 hanno mostrato un’alta attività cardioprotettiva legata all’attivazione del canale mito-KATP ,
con riduzione degli effetti vasorilascianti.
NH NH O NC OH N NC Cl O OH N NH Cl BMS-180448 BMS-191095
Osservando le caratteristiche strutturali peculiari dei principali KCOs, si può evidenziare che per ottenere una selettiva attività cardiaca sono necessarie le seguenti caratteristiche strutturali:
1) nucleo eterociclico benzopiranico
2) piccoli sostituenti lipofili in posizione 2 (Me, Et) 3) sostituente elettron-attrattore in posizione 6 ( )
4) sostituente ricco di elettroni in posizione 4 (X) a cui è legato un raggruppamento lipofilo aromatico che sembra essere essenziale per la selettività tissutale.
O RI RII X R Ar
X = catena ricca di elettroni R = CN, NOR 2, Br..
RI= CH3, RII = C2H5
Presso il laboratorio in cui ho svolto questa tesi di laurea sono stati sintetizzati composti 4-spiromorfolinici e 4-spiromorfolonici variamente sostituiti con raggruppamenti aromatici sull’azoto dello spirociclo con l’intento di valutare la loro attività cardioprotettiva.
I composti sintetizzati presentavano differenti sostituenti a livello dell’anello benzilico quali: il gruppo nitro (R’ = -NO2), gruppi elettronattrattori forti (R’ = -CF3, -Br), gruppi elettronattrattori deboli ( R’ = -NHCOCH3, -NHSO2CH3) e gruppi elettrondonatori (R’ = -NH2, -CH3). O N O R1 R O N O O R1 R A B
Questi composti sono stati testati come miscele racemiche alla dose di 40 mg Kg-1su cuori di ratto isolati alla Langendorff sottoposti a cicli di ischemia/riperfusione.
Il diazossido e il cromakalim, attivatori dei canali KATP, sono stati testati come farmaci di
riferimento rispettivamente alle dosi di 40 o 1 mg Kg-1.
Il diazossido possiede alle dosi testate un livello soddisfacente di selettività cardiaca, mentre il cromakalim è un potente attivatore benzopiranico dei canali KATP, che mostra
effetti cardioprotettivi ma anche marcate caratteristiche ipotensive a causa della mancanza di selettività.
Per ogni composto il danno ischemico è stato quantificato attraverso la valutazione del recupero funzionale dell’inotropismo durante la riperfusione (RPP rate pressure product). Un altro parametro utilizzato è quello morfologico che indica il rapporto percentuale tra area ischemica e area totale (Ai/Atot).
Alcuni dei derivati, sintetizzati in precedenza, avevano mostrato una buona attività cardioprotettiva nei confronti dell’insulto ischemico. Tra questi, il derivato spiromorfolonico 12 e gli analoghi sostituiti in posizione para dell’anello benzilico un gruppo amminico (-NH2) 1b , solfonamidico (-NHSO2CH3) 1c e acetamminico
(-NHCOCH3) 1d hanno mostrato una buona attività cardioprotettiva ed un’efficacia
Inoltre il derivato D sottoposto a studi farmacologici applicabili in vivo, aveva mostrato di possedere una buona attività cardioprotettiva e senza gli effetti ipotensivi e ipoglicemici collaterali, principali effetti limitativi per l’impiego in terapia di derivati benzocromanici nella prevenzione dell’ischemia cardiaca.
Tab.1 O N O O R compds R RPP 120’ (%) heart Ai/Atot (%) vehicle 31±4 37±4 cromakalim 94±17 25±1 diazoxide 47±9 28±8 1a H 35±9 33±3 1b p-NH2 53±9 19±2 1c p-NHSO2Me 70±24 23±3 1d p-NHCOMe 62±20 20±4
Con l’intento di approfondire le SAR di questa classe di composti, in questa tesi sono stati sintetizzatai: il composto 2 in cui è stato aggiunto un sostituente di tipo metilico sull’azoto amminico, e il composto 3 che possiede sull’azoto un metile e un acetile.
La sintesi dei composti 2 e 3 è stata effettuata seguendo la procedura riportata nello SCHEMA 1.
Il p-amminobenzil derivato 4 è stato sottoposto a trattamento con anidride trifluoroacetica in presenza di K2CO3 per dare il derivato 5. La successiva reazione di metilazione con
ioduro di metile e carbonato di potassio ha fornito il composto 6.
La reazione di deprotezione del derivato 6 ha fornito il derivato desiderato metilamminico 2 che in seguito a reazione con anidride acetica e carbonato potassio ha portato alla formazione del derivato amminico 3.
Il derivato p-amminobenzilico 13, intermedio necessario alla sintesi di 1 e 2, è stato sintetizzato come indicato nello SCHEMA 2.
L’ acetofenone commerciale 7 per reazione con acetone e pirrolidina a riflusso ha fornito il 2,2-dimetilcromano 8 che è stato successivamente sottoposto a reazione con il trimetilsilicianuro per ottenere il cianoderivato 9. La reazione di riduzione con LiAlH4 ha condotto alla formazione dell’amminoalcool 10; tale derivato è stato fatto reagire con il cloroacetilcloruro ottenendo il derivato 11. La successiva reazione di ciclizzazione in presenza di t-BuOK ha fornito il morfolone 12 che è stato sottoposto a reazione di benzilazione con il p-nitrobenzilbromuro che ha portato alla formazione dell’intermedio 13. Il derivato p-nitrobenzilico 13 è stato sottoposto a una reazione di riduzione con idrazina in presenza di FeCl3 per dare il derivato amminico 4.
Il composti 2 e 3 verranno testati come miscela racemica alla dose di 40 mg Kg
-1
su cuori di ratto isolato alla Langendorff, sottoposti a cicli di ischemia /riperfusione (30 minuti e 120 minuti rispettivamente).
Schema 2
O O OH O O OTMS NC O O H NH2 O O H NH Cl O O NH O O O N O O NO2 O N O O NH2 I II III IV V VI VII 7 8 9 10 11 12 13 4I: acetone, pirrolidina, toluene, 24h, riflusso; II: TMSCN, ZnI2, CH2Cl2, 4h, t.a.;
III: LiAlH4, THF, 2h, t.a.;
IV:ClCOCH2Cl, CH2Cl2, 2h, t.a.; V: t-BuOK, toluene, 2h, t.a.;
VI: p-nitrobenzilbromuro, NaH, DMF, 2h, N2; VII: NH2-NH2 · H2O, FeCl3, MeOH, 24h, riflusso;
Schema 1
O N O O NH2 a b O N O O NHCOCF3 O N O O NCH3COCF3 O N O O NHCH3 O N O O NCH3COCH3 c d 2 3 4 5 6a: anidride trifluoroacetica, K2CO3, acetone, 12h, N2;
b: MeI, K2CO3, acetone, 12h, t.a.;
c: K2CO3, MeOH, H2O, 1h, t.a.;
