DISEGNO DELLO STUDIO
1) OBIETTIVI
Il presente studio si propone di valutare i livelli plasmatici dei peptidi Aβ40, Aβ42 e del rapporto Aβ40/Aβ42 in un campione di pazienti affetti da depressione bipolare farmaco-resistente, correlandoli alla successiva risposta alla TEC.
Inoltre tali parametri biologici vengono posti in relazione alle caratteristiche del quadro psicopatologico ed all'entita` della compromissione cognitiva.
2) MATERIALI E METODI
a) Pazienti
Il campione di studio è costituito da 25 pazienti (13 uomini e 12 donne, con età media di 44 anni) affetti da Episodio Depressivo Maggiore (EDM) nel contesto di un Disturbo Bipolare tipo I o II, con o senza comorbidità lifetime per Disturbi d’Ansia e con o senza sintomi psicotici, in accordo con i criteri diagnostici del DSM-IV-TR (2000).
La diagnosi è stata confermata con la Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI) (Sheehan e coll, 1994).
I pazienti sono stati reclutati presso la Clinica Psichiatrica dell’Università di Pisa. I criteri di inclusione sono stati:
-età superiore o uguale a 18 anni; -EDM in atto;
-punteggio iniziale alla Hamilton Rating Scale for Depression a 21 items (HRSD-21) superiore o uguale a 20;
- storia di almeno 3 fallimenti terapeutici per l’EDM, incluso un trattamento con antidepressivi triciclici (TCA) (Thase & Rush, 1997; Fava, 2003). In particolare, l’insuccesso terapeutico in soggetti con disturbo bipolare era caratterizzato da persistenza di sintomi depressivi nonostante due cicli di terapia di almeno 8 settimane, di cui un ciclo con uno o più stabilizzanti dell’umore in associazione ad un TCA (200mg al dì di imipramina o un suo equivalente alla massima dose tollerata), ed un altro ciclo
con un inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina (SSRI) (40 mg al dì di fluoxetina o di un suo equivalente) combinato con uno stabilizzatore dell’umore ed un TCA.
I criteri di esclusione dallo studio sono stati i seguenti:
-diagnosi di Abuso o Dipendenza da Sostanze negli ultimi sei mesi; -gravidanza;
-pazienti non in grado di sottoscrivere un consenso informato;
- pazienti affetti da disturbi neurologici o internistici che limitassero l’uso della TEC. I pazienti sono stati valutati al baseline (T0) e successivamente dopo una settimana
dall’ultima applicazione di TEC (Tf): contestualmente alla valutazione clinica, è stato
effettuato un prelievo ematico per la determinazione dei livelli plasmatici dei peptidi Aβ. Per la valutazione del miglioramento della sintomatologia depressiva e della compromissione cognitiva al termine del ciclo di TEC e` stata considerata la “percentuale di miglioramento standardizzata”.
La “percentuale di miglioramento standardizzata della sintomatologia depressiva” e` calcolata dal rapporto [(HRSD tot score)baseline – (HRSD tot score)post-ect]/(HRSD tot score)baseline; la “percentuale di miglioramento standardizzata della compromissione cognitiva” e` calcolata dal rapporto [(MMSE tot score)post-ect – (MMSE tot score)baseline]/30-(MMSE tot score)baseline.
Il protocollo di studio è stato condotto in accordo con le linee guida del Servizio Sanitario Nazionale Italiano per una buona pratica clinica e con la Dichiarazione di Helsinki. È stata ottenuta l’approvazione dal Comitato Etico dell’Università di Pisa. Le interviste, effettuate dopo aver ottenuto il consenso informato scritto dai pazienti a cui si assicurava il completo anonimato dei dati clinici ottenuti, sono state condotte da un’equipe di valutatori che ha seguito un training di preparazione per la conoscenza degli strumenti da impiegare, al fine di ottenere la massima attendibilità e omogeneità delle valutazioni.
b) Strumenti di valutazione
Sono stati utilizzati i seguenti strumenti di valutazione:
a) Modulo anamnestico (Sistema Informativo per la Documentazione dell’Assistenza Psichiatrica).
Registra i Dati Anagrafici, l’Anamnesi Familiare, Fisiologica, le Condizioni Mediche Pregresse, il Pregresso Uso di Sostanze e l’Ananmesi Psichiatrica.
b) M.I.N.I. (Mini International Neuropsychiatric Interview) (Sheehan e coll, 1994). La M.I.N.I. è stata progettata come intervista strutturata breve per i disturbi psichiatrici, sia per l’Asse I del DSM-IV che per l’ICD-10. La M.I.N.I. è la capostipite di questa “famiglia”: è uno strumento breve, semplice, chiaro e facile da somministrare; nell’ultima versione (5.0.0, Agosto 1988) consente la diagnosi di 16 disturbi, 14 di asse I, un disturbo di asse II, il Disturbo Antisociale di Personalità, incluso per la sua stabilità nel tempo, per la consistenza dimostrata nei vari disturbi di personalità e per il suo impatto sulla clinica e sulla prognosi, ed il Rischio Suicidario. Richiede mediamente non più di 15 minuti per la sua applicazione e può essere utilizzata, oltre che dallo psichiatra, anche dal medico generale che abbia fatto un breve training. Nella M.I.N.I. l’attenzione è focalizzata sui sintomi attuali (con l’eccezione del disturbo bipolare, per il quale è rilevante sapere se un soggetto con un episodio depressivo in corso ha nell’anamnesi un episodio maniacale o ipomaniacale), senza domande relative alla disabilità, ai rapporti con la patologia somatica e con l’uso di sostanze. La M.I.N.I. consente, come abbiamo detto, di formulare 14 diagnosi di asse I (Episodio Depressivo Maggiore, Distimia, Episodio (Ipo)Maniacale, Disturbo di Panico, Agorafobia, Fobia Sociale, Disturbo Ossessivo-Compulsivo, Disturbo Post-Traumatico da Stress, Dipendenza/Abuso alcolico, Dipendenza/Abuso di Sostanze, Disturbi Psicotici, Anoressia Nervosa, Bulimia Nervosa e Disturbo d’Ansia Generalizzata), una di asse II (Disturbo Antisociale di Personalità) e quella di Rischio Suicidario. Non è consentita la diagnosi di Distimia in presenza di una Depressione Maggiore attuale e di Disturbo d’Ansia Generalizzata in presenza di una qualsiasi altra diagnosi di disturbo d’ansia. Il periodo valutato è specificato per ciascuna diagnosi e può andare dal momento dell’intervista a tutta la vita, in rapporto a ciò che è specificamente richiesto per ogni diagnosi. La M.I.N.I. viene generalmente impiegata una sola volta, in fase di inquadramento diagnostico del paziente.
c) HRSD-21 (Hamilton Rating Scale for Depression) (Hamilton, 1960). L’HRSD-21 è composta da 21 items; di questi, il nº 16, Perdita di peso, è suddiviso in due sub-items mutuamente esclusivi che esplorano il primo la perdita di peso riferita, l’altro quella misurata con la bilancia; anche l’item nº 18, Variazioni diurne, è suddiviso in due
sub-items, il primo che esplora la presenza di variazioni diurne della sintomatologia ed il
senso verso il quale vanno le eventuali variazioni (peggioramento mattutino o serale), l’altro la gravità delle eventuali variazioni. Generalmente i primi 17 items sono considerati quelli nucleari della depressione ed è su questi che di solito viene definito il
cut-off di gravità che può essere così schematizzato:
≥25 depressione grave 18-24 depressione moderata 8-17 depressione lieve ≤7 assenza di depressione.
La HRSD-21 è adatta per pazienti adulti con sintomatologia depressiva di qualsiasi tipo. La scala è utilizzabile nella valutazione delle variazioni della sintomatologia sotto trattamento e può essere impiegata, perciò, nella fase precedente e in quella successiva alla terapia.
d) CGI (Clinical Global Impressions) (Psychopharmacology Research Branch (PRB) del NIMH – USA) (Guy, 1976). La CGI è stata sviluppata per uno studio di vaste dimensioni sulla schizofrenia (PRB Collaborative Schizophrenia Studies). Ha lo scopo di valutare il rapporto rischio/beneficio (cioè l’efficacia) del trattamento in pazienti psichiatrici. È applicata dallo psichiatra il quale valuta ripetutamente, nel corso del trattamento, la gravità della malattia, le sue variazioni nel tempo e l’efficacia terapeutica, cioè il rapporto fra effetto terapeutico ed effetti indesiderati. La CGI è una scala “universale” che può essere impiegata per tutte le categorie di pazienti. La CGI consiste di 3 items : i primi due sono valutati su una scala a 7 punti, oltre alla risposta “Non è stato valutato”; il terzo, l’Indice di Efficacia, è una matrice simmetrica (4x4), che prevede 16 possibili risposte in rapporto alla diversa combinazione dell’ET e degli EC (più la risposta “Non valutato”). Ciascun item è valutato separatamente. Non esiste un punteggio totale. Il periodo da prendere in considerazione è, per la Gravità della Malattia, la settimana precedente, per il Miglioramento Globale e per l’Indice di Efficacia, invece, il tempo trascorso dall’inizio del trattamento. La scala è adatta per la valutazione del decorso clinico; la Gravità della Malattia deve essere valutata nel pre-trattamento e almeno una volta nel post-pre-trattamento; il Miglioramento Globale e l’Indice di Efficacia non devono essere valutati nel pre-trattamento e devono esserlo, invece, almeno alla fine del trattamento. Sono possibili (e consigliabili) valutazioni intermedie a discrezione del clinico.
e) MMSE (Mini-Mental State Examination) (Folstein e coll, 1975). E’ un test semplificato per la valutazione delle funzioni cognitive di tutti i soggetti. Richiede soltanto 5-10 minuti per la sua somministrazione e pertanto è diventato di impiego routinario. La sua somministrazione può essere ripetuta nel tempo al fine di ottenere
informazioni sull’evoluzione delle funzioni cognitive. E’ composto da 11 items suddivisi in due sezioni, una verbale ed una prestazionale. La prima sezione esplora l’orientamento (2 items), la memoria a breve termine (2 items), l’attenzione e la memoria di fissazione (1 item ciascuna); la seconda esplora, con un item ciascuna, la capacità di denominare gli oggetti, la ripetizione di frasi, l’esecuzione di comandi scritti e verbali, la scrittura spontanea di frasi con senso compiuto e la copiatura di una figura geometrica complessa. Il punteggio varia nei diversi items (0 - 1, 0 - 2, 0 - 3 e 0 - 5) in funzione della difficoltà della prestazione. Il cut-off per escludere la presenza di una compromissione cognitiva varia, in funzione dell’età e del grado di scolarizzazione, da 19 a 29.
c) Caratteristiche demografiche e cliniche del campione
Il gruppo di 25 pazienti depressi era costituito da 13 uomini e 12 donne con un’età media di 44 anni (± 11,9); 12 pazienti risultavano coniugati, 11 celibi/nubili, 1 vedovo e uno divorziato.
In 8 (32%) presentavano una diagnosi di Disturbo Bipolare I, i restanti 17 (68%) di Disturbo Bipolare II; 12 pazienti presentavano comorbidità lifetime per disturbo di panico e 6 per disturbo ossessivo-compulsivo (2 pazienti avevano entrambi i disturbi), nessuno presentava disturbo d'ansia generalizzata, disturbo post-traumatico da stress, fobia sociale o disturbi della condotta alimentare.
L'eta` d'esordio del disturbo dell'umore variava tra i 15 e i 54 anni (media: 28), in media i pazienti avevano 4 episodi affettivi pregressi e in 7 (28%) si riscontrava un'anamnesi positiva per tentativi di suicidio.
In precedenza i pazienti erano stati ospedalizzati in media 2 volte .
La durata dell'episodio depressivo in atto variava dai 6 ai 12 mesi (media: 8,7) e nel 40% dei casi (10 pazienti) presentava caratteristiche psicotiche.
Al baseline 20 pazienti (80%) avevano uno score CGI di 6 (“gravemente ammalato”), i
restanti 5 (20%) di 5 (“notevolmente ammalato”), inoltre, secondo la valutazione effettuata con l'HRSD-21, la maggior parte (23; 92%) presentava una depressione grave, i restanti (2; 8%) una depressione di gravita` moderata.
La media del punteggio MMSE prima della TEC era di 23,4 con punteggi che variavano tra un minimo di 21 e un massimo di 27.
d) Trattamento con TEC
Prima di sottoporre i pazienti alla TEC, di ognuno si sono valutate le condizioni mediche generali attraverso un esame clinico generale comprendente un’anamnesi accurata, un esame obiettivo generale e neurologico, esame del sangue e delle urine, elettrocardiogramma, radiografia del torace, TC del cranio. L’anestesia è stata indotta con un’iniezione endovenosa di tiopentale (2-4 mg/kg e.v.) e succinilcolina (0,5-1 mg/kg e.v.). L’energia in forma di onde rettangolari ad impulso breve bidirezionale è stata emessa mediante Mecta Spectrum 5000 (Mecta Corporation, Lake Oswego, USA) due volte alla settimana tra le ore 7:00 e le ore 9:00. L’intensità dell’energia è stata scelta in base all’età del singolo paziente ed in modo tale che la durata della crisi comiziale (misurata con elettroencefalogramma) fosse di almeno 25 secondi. Se invece la durata era inferiore ai 25 secondi, l’energia veniva incrementata (di 1,5 volte) alla seduta successiva. Altri parametri vitali venivano monitorati con il pulsossimetro e con l’elettrocardiogramma. I pazienti ricevevano una ventilazione assistita con ossigeno al 100% fino alla ripresa della respirazione spontanea. Per ogni paziente la durata del ciclo di TEC veniva stabilita sulla base della valutazione clinica dei medici specialisti curanti. In ogni caso, il numero medio di applicazioni effettuate è stato 8 (con un range di 6-10).
e) Metodi di laboratorio
I pazienti che hanno accettato di partecipare allo studio e hanno sottoscritto il consenso informato sono stati sottoposti a prelievo ematico per il dosaggio dei peptidi della βamiloide Aβ40 e Aβ42.
Per il dosaggio plasmatico di tali peptidi il campione e` stato raccolto in una provetta con litio-eparina (6ml), quindi centrifugato a 2500 rpm x 10 min.
Il plasma viene aliquotato in eppendorf e conservato a –20°C. L’analisi dei livelli di Aβ40 e Aβ42 viene fatta tramite appositi kit ELISA (Invitrogen Hu Aβ40 e Aβ42) . I campioni vengono incubati a 4°C con anticorpi anti-Aβ40 e anti-Aβ42.
L’anticorpo monoclonale specifico per la regione NH2 –terminale della Aβ umana è adeso sul fondo dei pozzetti della piastra, i campioni e gli standard vengono quindi co-incubati con anticorpi di coniglio specifici per l’estremità COOH della sequenza di Aβ40 o Aβ42. Successivamente, la quota di anticorpo legata viene messa in evidenza incubando con anticorpi anti-IgG di coniglio coniugati con HRP (Horseradish peroxidase). L’aggiunta del substrato cromogeno (TMB) determina la produzione di
colore che è direttamente proporzionale alla concentrazione di Aβ nel campione. La misura dell’ assorbanza è stata effettuata a 450nm utilizzando un lettore per piastre (Biorad). La concentrazione rilevabile minima è 6 pg/ml per la Aβ40 e 10 pg/ml per la Aβ42.
f) Metodi statistici
I dati raccolti sono stati registrati in un database costruito appositamente, quindi sono stati elaborati mediante un programma statistico.
Il confronto tra variabili quantitative a distribuzione non gaussiana e` stato condotto tramite test statistici non parametrici: in particolare, per il confronto tra campioni indipendenti e` stato impiegato il test di Mann-Whitney mentre per il confronto di dati appaiati il test di Wilcoxon .Per il confronto tra le variabili categoriali e` stato utilizzato il test del chi quadrato mentre il confronto tra variabili a distribuzione gaussiana e` stato condotto con il test T di Student per campioni indipendenti.
Per le correlazioni di variabili non a distribuzione gaussiana e` stato utilizzato il coefficiente di Spearman, per le correlazioni di variabili a distribuzione gaussiana il coefficiente di correlazione di Pearson.
Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando lo Statistical Package for the
