Lo sviluppo del Sistema Nervoso
La Neurulazione
Al termine della gastrulazione, l'embrione ha una forma allungata sull'asse antero-posteriore e le cellule mesodermiche che derivano dall'involuzione del labbro dorsale del blastoporo, dette cordomesoderma assiale, inducono la formazione del tubo neurale nell'ectoderma sovrastante (Bernardini et al., 1999; Hausen P, Riebesell M, 1991). Tale processo di induzione e di "guida" da parte del mesoderma sull'ectoderma è definito neurulazione. Il tubo neurale rappresenta il primordio embrionale del sistema nervoso centrale. La formazione del tubo neurale prevede tre fasi distinte. Dapprima si ispessisce lo strato più interno dell'ectoderma dorsale (lo strato sensoriale) a formare la piastra neurale (Figura 4a). La piastra è delimitata da foglietti neurali le cui cellule si allungano a formare un epitelio colonnare. Le cellule superficiali mediali, dorsali dello strato sensoriale formano la notopiastra e contraggono gli apici assumendo la caratteristica forma "a bottiglia", contribuendo all’avvallamento del pavimento neurale (Figura 4b). I foglietti neurali si apprestano sulla linea mediana e la zona mediana si affonda formando la doccia neurale (Figura 4c). Le cellule colonnari vanno incontro ad un’attiva proliferazione che contribuisce al progressivo avvicinamento delle pieghe neurali sulla linea mediana fino a che esse non si toccano e si fondono formando il tubo neurale che racchiude il canale neurale (Figura 4d). I foglietti neurali si fondono sulla linea mediana a partire dalla regione centrale dell'embrione procedendo sia posteriormente (più velocemente) che anteriormente (più lentamente) lasciando aperti due neuropori ai lati opposti dell'embrione. Il tubo neurale è sovrastato dall’ectoderma di superficie o epidermico al quale rimane collegato tramite le creste neurali. Con la migrazione delle cellule delle creste neurali, il tubo neurale rimane separato dall’ectoderma epidermico (Figura 4d).
Tutto il sistema nervoso centrale origina dal tubo neurale: la regione anteriore darà origine al cervello, mentre quella posteriore al midollo spinale. Le cellule delle creste neurali daranno origine ai gangli spinali e al sistema nervoso autonomo, ma
non solo. Le creste neurali, infatti, consistono in un gruppo di cellule che non partecipa alla formazione del tubo neurale e che, creata una cresta lungo la linea mediale dorsalmente al tubo neurale, migrano per dare origine a strutture non necessariamente nervose. Nelle regioni cefaliche daranno origine a tessuti connettivi e scheletrici della testa, oltre che ai gangli cefalici; nella regione del tronco formeranno sia le cellule pigmentate sia le radici dorsali dei gangli (Bernardini et al., 1999; Hausen P, Riebesell M, 1991).
Figura 1.Formazione del tubo neurale. Il bordo della piastra neurale (in verde) è indotto dal neuroectoderma (in viola), dall’ectoderma non neurale (in azzurro) e dal mesoderma parassiale sottostante (in giallo). Durante la neurulazione i bordi della piastra neurale (i foglietti neurali) si elevano causando il ripiegamento della piastra neurale in una doccia neurale prima e in un tubo neurale poi. Le cellule della cresta neurale (in verde) delaminano dai foglietti neurali, distaccando il tubo neurale dall’ectoderma sovrastante.
Formazione del campo dell’occhio
La prima evidenza morfologica della formazione dell'occhio nei vertebrati è l'espansione bilaterale di tessuto dal diencefalo precoce per formare la vescicola ottica. Ancor prima della formazione della vescicola ottica però, al momento della neurulazione, nella piastra neurale anteriore inizia a esprimersi un gruppo di fattori di trascrizione, definiti "eye field transcription factor" (EFTF) per l'identità che conferiscono a questa regione: il territorio presuntivo della retina, anche detto campo morfogenetico dell’occhio (in inglese “eye field”). Tali fattori includono ET, Rx1, Pax6, Six3, Six6, tll e Lhx2 (Zuber et al., 2003). Quanto siano determinanti per la formazione dell'occhio nei vertebrati è stato dimostrato non solo nello Xenopus laevis (Zuber et al., 1999; Andreazzoli et al., 1999), ma anche nell'essere umano (Wawersik and Mass, 2000) e nel topo (Mathers et al., 1997).
La formazione dell'eye field dipende da una serie di induzioni progressive (Figura 5).
Tutto ha inizio con l'induzione neurale dell'ectoderma allo stadio 10.5 da parte di Noggin, Chordin e Follistatin che sono in grado di inibire la via di segnalazione di BMP4, legandosi fisicamente a questo fattore TGFβ. La repressione di BMP4 è necessaria, infatti, per convertire l’ectoderma “uncommitted” in neuroectoderma (Zimmerman et al., 1996). Successivamente il prosencefalo presuntivo viene specificato da Otx2 nella regione neurale anteriore. A stadio 13 Otx2 viene soppresso nella regione più centrale dell’eye field, occupata da Rx1, continuando a marcare solo il contorno di tale zona (Bailey et al., 2004; Zuber et al., 2003). Tale espressione riflette un significato funzionale ben preciso: il centro dell’eye field formerà la neuroretina, la periferia l’epitelio pigmentato retinico (Martinez-Morales et
al., 2003). Otx2 è in grado inoltre, di interagire con un gene che contiene una T-box,
chiamato ET. Il compito di Otx2 è probabilmente quello di inibire l’azione inibitrice di noggin su ET, permettendo, in modo indiretto, l’espressione di questo gene T-box (Zuber et al., 2003).
La regione centrale dell’eye field comincia a esprime, a stadio 12/13, oltre a ET, anche Pax6, Rx1 e Six3 (Zuber et al., 2003), tutti fattori cruciali per la formazione dell’occhio. Allo stadio 14/15 viene attivata anche l’espressione di tll e Six6 a
marcare una striscia di cellule della regione precordale della piastra neurale. Six6 è espresso nei precursori in proliferazione dell’occhio e la sua sovraespressione comporta l’iperproliferazione delle cellule retiniche (Zuber et al., 1999). Dallo stadio 16 in poi i primordi dell'occhio si formano dalla piastra neurale anteriore (Hausen and Riebesell, 1991).
La formazione dell'occhio è un processo che richiede perciò una specificazione graduale in cui diversi geni entrano in campo influenzandosi direttamente o indirettamente.
All'interno dell'eye field, i pattern di espressione degli EFTF seguono in modo dinamico la morfogenesi della piastra neurale, compresa la migrazione laterale dell'eye field, non appena questo comincia a separarsi (Figura 6). Quindi, la piastra neurale anteriore è suddivisa in diversi domini molecolari che esprimono un sottoinsieme specifico di EFTF, seguendo un ordine temporale preciso.
Figura 2. Modello schematico del network di interazioni epigenetiche tra i geni responsabili dell’induzione del campo dell’occhio nella piastra neurale anteriore. In celeste la piastra neurale, in azzurro il territorio di espressione di Otx2 e in blu scuro l’eye field.
Figura 3. Sovrapposizione dei pattern di espressione dei fattori di trascrizione dell’eye
field (EFTF) in un embrione di Xenopus laevis a
Morfogenesi dell’occhio
La retina discende da 9 blastomeri di un embrione a 32 cellule. Ognuno di questi blastomeri dà origine a una porzione diversa della retina, in percentuali diverse (Figura 7) (Perron and Harris, 1999).
Durante la neurulazione, l'area presuntiva dell'occhio si separa in due primordi, dando origine alla disposizione bilaterale degli occhi. Come conseguenza di questo, marcatori della morfogenesi del campo dell'occhio (Pax6, Xrx1 a Xsix3) tracciano dapprima una unica banda, che solo in seguito si divide in due regioni laterali. In questo meccanismo è il mesoderma precordale a giocare un ruolo importante, dal momento che la
sua rimozione da embrioni allo stadio di neurula comporta un fenotipo ciclopico (Li et
al., 1997). Negli ultimi anni e’ stato chiarito che questo evento e’ dovuto alla
segnalazione di sonic hedgehog, secreto dalla sottostante piastra precordale, che e’ in grado di riconvertire la parte mediana del campo dell’occhio in diencefalo ventrale (Chiang et al., 1996 Hatta et al., 1991, Geng et al., 2008).
Dopo la chiusura della piastra neurale in tubo neurale, le cellule della regione ventrale anteriore dello stesso tubo neurale evaginano fino a entrare in contatto con l'ectoderma sovrastante, per formare le vescicole ottiche. Queste raggiungono l’epidermide che in seguito formerà la lente. E’ proprio il contatto stretto fra vescicola ottica ed epidermide sovrastante, infatti, a indurre la formazione della lente in questa specifica regione dell’epidermide e non in altre (Perron and Harris, 1999).
Cellule localizzate in posizioni diverse all'interno della vescicola ottica danno origine a 3 scomparti morfologicamente e funzionalmente differenti: il peduncolo ottico, l'epitelio retinico pigmentato (RPE) e la retina neurale. Man a mano che le vescicole ottiche crescono, si allontanano dal prosencefalo e vi rimangono connesse solo tramite il peduncolo ottico.
La parte anteriore della vescicola ottica, che comincia a invaginarsi, formerà la retina neurale, mentre la parte posteriore l'epitelio pigmentato. Il completamento
Figura 4. Embrione a 32 cellule (stadio 6) visto dall’emisfero animale. Percentuale della retina a cui ognuno dei 9 blastomeri indicati dà origine.
dell’ invaginazione porta alla formazione della coppa ottica, costituita da un sottile stato esterno da cui originera’ l’epitelio pigmentato ed uno strato interno piu’ spesso che costituira’ la retina neurale. (Perron and Harris, 1999).
La retina comincia ad avere le caratteristiche della retina matura e compare la zona marginale che permetterà la crescita della retina anche nella fase adulta, in proporzione alle dimensioni dell’intero organismo.
Il processo di differenziamento delle cellule retiniche porta alla sottodivisione della retina in tre strati differenti. Come la retina di tutti i vertebrati, quella di
Xenopus contiene due strati sinaptici (gli strati plessiformi interno ed esterno),
intercalati fra tre strati nucleari: lo strato nucleare esterno, quello interno e lo strato di cellule gangliari.
Lo strato nucleare esterno comprende i fotorecettori: i coni e i bastoncelli (Figura 8). I coni sono responsabili della visione diurna e della discriminazione dei colori mentre i bastoncelli sono gli addetti alla visione crepuscolare e notturna. Due diverse popolazioni di bastoncelli sono state identificate, una particolarmente sensibile al verde e un'altra debolmente sensibile al blu. Tre sono i differenti tipi di coni nello
Xenopus: sensibili al rosso, al blu o al verde, al violetto.
Lo strato nucleare interno contiene i corpi cellulari delle cellule di Müller, le orizzontali, le amacrine e le bipolari. Per ogni classe di neuroni, ne sono stati identificati diversi sottotipi sulla base delle loro differenze neurochimiche (Perron and Harris, 1999).
Nello strato gangliare si trovano diversi tipi di cellule ganglionari retiniche (RGC) responsabili dei contatti col sistema nervoso centrale. Le cellule ganglionari sono le prime a differenziare, seguite dai coni e dalle cellule orizzontali, per ultimi i bastoncelli, le bipolari e le cellule di Müller (Holt et al., 1988) (Figura 9).
Figura 5. Disposizione delle cellule all’interno della retina stratificata. Coni (in arancione) e bastoncelli (in viola) occupano lo strato nucleare esterno (ONL); i corpi cellulari delle cellule gliali di Müller (bianco-celeste), delle amacrine (in verde), delle bipolari (in giallo) e le cellule orizzontali (in azzurro) riempiono lo strato nucleare interno (INL); le cellule gangliari (in rosso) costituiscono lo strato delle cellule gangliari (GCL). Gli strati plessiformi intermedi sono costituiti dai processi dendritici delle cellule retiniche, separando gli strati cellulari.
Retinogenesi post-embrionale - la Zona Marginale Ciliare (CMZ)
Le cellule del neuroepitelio retinico, originatesi in corrispondenza dello strato interno della coppa ottica, si espandono, escono dal ciclo cellulare, stratificano e differenziano per formare infine la retina matura. Ogni tipo cellulare retinico ha origine da un unico gruppo di retinoblasti indifferenziati apparentemente equivalenti (Holt et al., 1988) e differenzia al momento opportuno, secondo un preciso ordine, dopo un certo numero di divisioni cellulari (Figura 12). Negli anfibi la proliferazione delle cellule retiniche continua anche nella fase adulta, grazie alla cosiddetta “zona marginale ciliare” (CMZ). Questa regione traccia un anello attorno al cristallino, se si considera l’occhio nelle tre dimensioni dello spazio (Figura 9), mentre in sezione, la CMZ è rappresentata dalla zona più periferica di retina immediatamente attaccata alla lente (Figura 10).
La CMZ contiene dalla periferia al centro della retina, cellule staminali multipotenti, retinoblasti pluripotenti e precursori neuronali in differenziamento che non si dividono più (Harris e Perron, 1998).
Esiste una sorta di gradiente di sviluppo nella CMZ, dalla periferia al centro che riflette l’attivazione gerarchia di geni di multipotenza e di differenziamento. Se si considera la CMZ una
istantanea di ciò che accade nell’embriogenesi, allora i geni espressi più in periferia sono anche quelli che si esprimeranno nelle fasi più precoci dello sviluppo dell’occhio. L’espressione differenziale di questi geni, divide la CMZ in quattro zone (Figura 11). Le cellule all'estrema periferia sono quelle staminali, in grado di dare origine alla retina, all'epitelio pigmentato e ad altre cellule staminali; esprimono Xrx1, XSix3 e Pax6. La zona immediatamente successiva, procedendo verso il centro della retina, contiene la progenie delle cellule staminali più profonde: si tratta dei retinoblasti, cellule ancora mitotiche che sebbene abbiano perso la multipotenza, possiedono
Figura 7. Schema di una retina in sezione. Figura 6. La CMZ in un occhio
visto tridimensionalmente. In alto a destra sono riportati gli assi dell’embrione. A = anteroriore, P = posteriore, D = dorsale, V=ventrale.
ancora la capacità di generare diversi tipi di cellule retiniche neuronali e non neuronali. E’ la zona dei retinoblasti in proliferazione che, oltre a esprimere ancora i geni della regione staminale, esprimono anche X-Delta-1, X-Notch-1, Xash1 e Xash3. Nella terza zona le cellule esprimono, oltre a tutti i geni delle zone precedenti (con una consistente diminuzione di espressione di Xash-3), XATH-3, Xath-5, neuro-D e Xotx2 (Harris e Perron, 1998).
L’ultima zona, la più centrale esprime la stessa combinazione di geni (tranne Xash-3) ma le cellule hanno smesso di proliferare. Le cellule più centrali della CMZ, sebbene sembrino indifferenziate, sono ormai fuori dal ciclo cellulare e si stanno avviando verso il differenziamento di uno specifico tipo cellulare retinico. La quarta zona è quindi quella di differenziamento vero e proprio, che vede l’accensione di alcuni geni e lo spegnimento di altri.
Per esempio, le cellule che prendono posizione nello strato delle gangliari mantengono accesi solo tre geni: XSix3, Pax6 e Brn-3.0. Allo stesso modo, le cellule degli altri strati retinici attiveranno solo una data combinazione di geni (Harris e Perron, 1998). La successione dell'espressione dei geni, così chiaramente ordinata spazialmente permette di scoprire i passaggi molecolari durante la retinogenesi, costituendo un chiaro modello di quali geni siano a monte di altri.
La sfida in futuro sarà interferire con l'espressione di questi geni nella CMZ, per testare le potenzialità di queste cellule e la funzione di quei geni espressi durante lo sviluppo della retina.
Figura 9. Successione del differenziamento dei neuroni retinici.
Figura 8. Le quattro zone della CMZ (zona marginale ciliare).
