III
ABSTRACT
In questo lavoro di tesi è stata caratterizzata la risposta immune a peptidi citrullinati in pazienti affetti da artrite reumatoide (AR). La produzione di anticorpi specifici per proteine/peptidi citrullinati (ACPA) è, infatti, caratteristica esclusiva dei pazienti con AR. Nel lavoro sono stati utilizzati quattro peptidi precedentemente individuati nel laboratorio: due derivati da antigeni esogeni e due da autoantigeni. I due peptidi derivati da antigeni esogeni corrispondono a sequenze di altrettante proteine codificate dal virus di Epstein-Barr, EBNA 1 ed EBNA 2; i due peptidi derivati da autoantigeni corrispondono a sequenze dell’istone H4. In tutti i peptidi, la sequenza è stata modificata, sostituendo all’arginina presente nella proteina l’aminoacido non naturale citrullina; sono stati tutti sintetizzati come peptidi ramificati, o “Multiple Antigen Peptides”, per migliorarne l’antigenicità.
Utilizzati sulla fase solida in test ELISA, questi peptidi rilevano anticorpi pressoché esclusivamente nei sieri di AR; confrontando i risultati ottenuti con i vari peptidi, si nota che nonostante un’alta correlazione esistono sieri positivi solo con un metodo e negativi con gli altri. L’esistenza di sieri che reagiscono con un solo peptide e di sieri reattivi con più peptidi può dipendere dalla presenza nei sieri di popolazioni diverse di anticorpi, ciascuna reattiva con un peptide oppure da popolazioni indipendenti di anticorpi, ciascuna reattiva con un solo peptide. Per distinguere fra queste possibilità, abbiamo studiato le proprietà degli anticorpi anti-peptide purificati per cromatografia di affinità su colonne di Sefarosio cui è legato il peptide. I risultati dei test di inibizione indicano la cross-reattività degli anticorpi con le diverse sequenze citrullinate. L’affinità degli anticorpi anti-peptidi citrullinati è stata valutata mediante Analisi delle Interazioni Biomolecolari (Biomolecular Interaction Analysis,
BIA) effettuata con il sistema BIAcore® .
I risultati indicano un’affinità simile per i vari anticorpi anti-peptide.
L’attività biologica degli anticorpi è stata valutata su colture di sinoviociti di tipo fibroblastico (FLS), ottenuti da frammenti di tessuto sinoviale prelevato durante sinoviectomie. Gli anticorpi anti-peptidi citrullinati sono stati incubati a tempi e concentrazioni differenti su sinoviociti prelevati da pazienti con AR oppure da pazienti con osteoartrosi (OA) ed è stato valutato il pattern di citochine prodotte nel supernatante di coltura.
In esperimenti preliminari è stato utilizzato un multiarray specifico per citochine umane ed è stato osservato un deciso aumento di produzione di RANTES a seguito
IV
dell’incubazione dei FLS con anticorpi anti-peptidi citrullinati. Il risultato iniziale è stato confermato in altri esperimenti in cui i supernatanti sono stati valutati mediante ELISA “classico”, basato su anticorpi monoclonali e policlonali specifici per RANTES. E’ risultato che gli anticorpi anti-peptidi citrullinati inducono produzione di RANTES da parte dei FLS; tale produzione è particolarmente elevata quando i FLS derivano da pazienti con AR.
