Università degli Studi di Pisa
Facoltà di Agraria
Laurea Specialistica in Biotecnologie Vegetali e Microbiche
Influenza di diversi fattori abiotici sulla risposta
al congelamento di Arabidopsis thaliana
Relatore: Dott. Lorenzo Guglielminetti
Candidata: Beatrice Giuntoli
La vera via passa per una corda che non è tesa in alto, ma appena al di sopra del suolo. Sembra destinata a far inciampare più che a essere percorsa.
Poiché la tesi è, per sua natura, posta a conclusione degli anni universitari, vorrei qui ringraziare almeno alcune delle persone che mi hanno accompagnata durante questo periodo, tanto ricco e importante.
Il primo dei ringraziamenti non può che essere rivolto ai miei genitori: per l'amore con cui hanno sostenuto i miei studi scolastici, fin dall'epoca delle aste sul quaderno a quadrettoni, il lungo percorso musicale e, da ultimo, le mie fatiche accademiche, e per la pazienza dimostrata nell'accettare tanto la mia assenza da casa quanto le fluttuazioni del mio umore nei momenti più impegnativi. Al resto della famiglia, e in particolare ai miei nonni Antonio, Maria, Gino e Ilva vanno il mio pensiero, il mio affetto e la mia dedica.
Molte persone hanno condiviso con me le esperienze, vissute e libresche, di cui questi anni sono composti. Devo, quindi, mille e un grazie alla mia seconda famiglia pisana: a Manuela, latrice di notizie dal mondo esterno, Damiano, ingegnere curioso nonché unico "uomo di famiglia", ed Elisa, amica fraterna, compagnia immancabile nelle ore felici e supporto insostituibile nei momenti difficili. Una menzione speciale è riservata, inoltre, ai miei agrari preferiti: Alice, Leonardo (quante ore passate a discutere di scienza sfortune e vita?!), Francesco (per avermi più volte dimostrato che anche i migliori possono sbagliare...), Eleonora e Giovanni.
A Letizia spetta un ringraziamento particolare per la pazienza, infinita, con cui ha tollerato i miei troppi impegni.
Lo spazio, tiranno, mi impedisce di elencare tutti coloro che non mi hanno mai fatto mancare amicizia, stima e sostegno, a partire dal Maestro e da Annarosa. Le parole restano, anche in questo caso, poca cosa rispetto al tempo trascorso insieme e agli eventi condivisi. All'intero corpo allievi della Scuola e ai docenti del settore di Agraria va, in breve, tutta la mia gratitudine per aver contribuito alla mia crescita durante i cinque anni passati.
Per quanto attiene più strettamente a questa tesi, infine, non posso esimermi dal ringraziare Lorenzo, per le conoscenze trasmessemi e la fiducia dimostratami, Francesca e Sara, senza i cui consigli tecnici e la cui assistenza materiale probabilmente questo lavoro non sarebbe mai arrivato in porto, e le persone che, prendendo a cuore le sorti della mia tesi (o forse più che altro dell'integrità del laboratorio), mi hanno aiutato a sciogliere dubbi e problemi.
INDICE
1. INTRODUZIONE 1
1.1. Le piante e gli stress da freddo e da congelamento 1 1.1.1. Effetti delle basse temperature sulle cellule e sui tessuti
vegetali 1
1.1.2. La risposta agli stress da basse temperature 12
1.2. Regolazione trascrizionale dei geni indotti da basse
temperature 24 1.2.1. Reti di regolazione trascrizionale 24
1.2.2. La via CBF 26
1.2.3. Nuove vie regolative nella risposta al freddo 34
1.2.4. Cenni sulla regolazione della risposta agli stress osmotici,
salini e da disidratazione 39
1.3. Percezione e trasduzione del segnale 41 1.3.1. Specificità e cross-talk nelle vie di segnalazione degli stress
abiotici 41
1.3.2. Sensori di membrana 43
1.3.3. Ruolo del calcio 44
1.3.4. Altri messaggeri secondari 48
1.3.5. Cascate fosfoproteiche 51
1.4. Proteomica della tolleranza alle basse temperature 53 1.5. Applicazioni biotecnologiche 58
2. SCOPO 62
3. MATERIALI E METODI 64
3.1. Preparazione del materiale vegetale 64 3.1.1. Materiale vegetale e condizioni di crescita 64
3.2. Parametri fenotipici e tolleranza allo stress 66 3.3. Determinazione del contenuto di pigmenti fogliari 67 3.4. Valutazione della stabilità delle membrane 68 3.5. Analisi degli zuccheri liberi 70 3.5.1. Estrazione dei metaboliti (acido-base) 70
3.5.2. Procedura per la determinazione enzimatica degli zuccheri
liberi 71
3.6. Elettroforesi bidimensionale 73 3.6.1. Estrazione delle proteine cellulari totali per 2DE 73
3.6.2. Quantificazione delle proteine 75
3.6.3. Isoelettrofocalizzazione su gradiente di pH immobilizzato
(IEF su Ipg) 76
3.6.4. Condizionamento delle strisce di prima dimensione 77
3.6.5. SDS-PAGE 78
3.6.6. Colorazione dei gel mediante "Silver staining" 79
4. RISULTATI 81
4.1. Tolleranza allo stress di congelamento 81 4.2. Contenuto di pigmenti fogliari 83
4.3. Stabilità delle membrane 84
4.4. Dati fenotipici 86
4.5. Zuccheri liberi 89
4.6. Elettroforesi bidimensionale 95
5. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI 98
5.1. Effetti fenotipici dei trattamenti 98 5.2. Effetti dei trattamenti sulla tolleranza al congelamento 99
5.2.1. Età 20d 99
5.2.2. Età 35d 101
5.4. Effetti dei trattamenti sui profili proteici 104