Capitolo 4
RISULTATI
4.1 VALUTAZIONE DELL’IMMUNOCOMPATIBILITA’ IN CONDIZIONI STATICHE
4.1.1 Analisi morfologica dei campioni in PEtU-PDMS
I campioni per lo studio statico sono stati realizzati mediante procedura casting (Figura 1-A) e mediante procedura spray (Figura 1-B) utilizzando una soluzione di PEtU-PDMS al 3 % e al 2 % rispettivamente.
In Figura 2 è mostrata l’analisi microscopica dei campioni, processati mediante le due differenti procedure di fabbricazione, eseguita attraverso osservazione allo stereo-microscopio in seguito a colorazione con il Nero Sudan. Questa analisi ha dimostrato che i campioni in PEtU-PDMS hanno una superficie non porosa, che si presenta più liscia e regolare se i campioni sono processati per
Figura 1. Fotografia di un campione in PEtU-PDMS ottenuto mediante le metodologie A) casting e B) spray.
casting mentre è tendenzialmente rugosa se sono processati per spray.
Gli stessi campioni sono stati sottoposti ad analisi microscopica mediante osservazione al SEM che ha consentito di valutarne la micro-struttura superficiale. Questa è risultata, per i materiali ottenuti mediante casting, non lamellare compatta e caratterizzata da evidenti micro-concavità superficiali (diametro
medio di ∼ 15μm) presenti soprattutto sulla superficie a contatto
con il substrato utilizzato per ottenere le membrane (Figura 3A). Lo strato superficiale dei campioni ottenuti mediante spray si presenta compatto, anche se piuttosto irregolare (Figura 3B).
A
Figura 2. Fotografie acquisite allo stereo-microscopio (O.M. 60X), in seguito a colorazione con Nero Sudan, di campioni in PEtU-PDMS ottenuti mediante le metodologie A) casting e B) spray.
4.1.2 Valutazione dell’induzione di apoptosi linfomonocitaria
L’induzione di apoptosi è stata valutata mediante il saggio dell’Annessina V e PI. Esperimenti preliminari sono stati condotti per valutare la densità ottimale di cellule da seminare e per individuare il controllo positivo di apoptosi per le condizioni sperimentali applicate. A questo scopo i PBMCs sono stati incubati per tempi differenti (12, 24 e 48 ore) con sostanze ad azione pro-apoptotica come il Tumor necrosis factor-α (TNF-α), l’Interferone-γ
(INF-γ), l’Etoposide e il perossido di idrogeno H2O2 in presenza o
meno di diverse sostanze attivanti come Forbol 13 acetato 12 miristato (PMA), ionomicina e lipopolisaccaride batterico (LPS), o con Fitoemoagglutinina (PHA). Al termine delle suddette prove, una soluzione di Etoposide (500μg/ml) e PHA (5μg/ml) incubata con le
Figura 3. Immagini acquisite al SEM (O.M. 500X) della superficie di campioni in PEtU-PDMS ottenuti mediante le metodologie A) casting e B) spray.
cellule per 24 ore a 37 °C è stata scelta come controllo positivo di apoptosi.
I risultati dell’analisi citofluorimetrica dei PBMCs incubati per 24 ore con gli estratti dei materiali sono espressi come percentuale di positività nei confronti delle due marcature: le cellule positive
per l’Annessina V e negative per il PI (FITC+, PI-) sono in fase
precoce di apoptosi, mentre le cellule positive per entrambe (FITC+,PI+) sono in apoptosi tardiva/necrosi.
I risultati indicano che gli estratti dei campioni in PEtU-PDMS processati mediante metodologia casting, indipendentemente dalla percentuale di PDMS, e del PDMS di riferimento inducono un valore di apoptosi precoce significativamente superiore rispetto al controllo negativo. Il livello di apoptosi tardiva/necrosi risulta, invece, paragonabile ai materiali di riferimento ed al controllo negativo (Figura 4). Per quanto riguarda gli estratti dei materiali processati mediante metodologia spray, è stato osservato che solamente quelli ottenuti dai campioni con il più alto contenuto di PDMS inducono un valore di apoptosi precoce statisticamente significativo rispetto al controllo negativo e al PEtU di riferimento; il valore di apoptosi tardiva/necrosi è risultato paragonabile a quello ottenuto per i materiali di riferimento e per il controllo negativo (Figura 5).
11 24 13 23 9 28 19 17 12 24 11 15 0 8 15 23 30 38 45 PEtU-PDMS
PEtU-PDMS RMsRMs PEtU-PDMSPEtU-PDMS RMsRMs
F i g u r a 5 . Pe rc en tu a l e d i P B M C s in ap o p to s i p r eco c e ( F IT C+, PI-) e tardiva (FITC+, PI+) dopo 24 ore di incubazione con gli estratti di campioni in
PEtU-PDMS processati mediante spray e dei materiali di riferimento. I dati sono riportati come media ± S.D. dei valori ottenuti in cinque esperimenti indipendenti. L’analisi statistica è stata effettuata con il t test di Student, (p< 0,01) * vs controllo negativo e PEtU processato per spray.
Apoptosi precoce Apoptosi tardiva/necrosi
c e llu le p o si ti v e ( % ) * 10% 30% 50% 10% 30% 50% PEtU-PDMS controllo negativocontrollo negativo ePTFE PEtU ePTFE PEtU RMs
F i g u r a 4 . Percen t u al e di PBMC s i n apop t o si preco c e (FI T C+, PI-) e tardiva (FITC+, PI+) dopo 24 ore di incubazione con gli estratti di campioni in
PEtU-PDMS processati mediante casting e dei materiali di riferimento. I dati sono riportati come media ± S.D. dei valori ottenuti in cinque esperimenti indipendenti. L’analisi statistica è stata effettuata con il t test di Student, (p< 0,01) * vs controllo negativo, ε vs PDMS processato per
casting. 29 15 31 15 28 16 12 21 16 37 27 14 11 18 0 10 20 30 40 50 * * c e llu le p o si ti v e ( % ) PEtU-PDMS
PEtU-PDMS RMsRMs PEtU-PDMSPEtU-PDMS RMsRMs
Apoptosi precoce Apoptosi tardiva/necrosi
controllo negativocontrollo negativo 10% 30% 50% 10% 30% 50% PEtU-PDMS PDMS PEtU LDPE PDMS PEtU LDPE RMs * * ε ε ε
4.1.3 Quantificazione citofluorimetrica della produzione citochinica monocitaria
La valutazione della produzione citochinica monocitaria è stata eseguita mediante il saggio fluorescent bead immunoassay applicato alla citometria a flusso.
Esperimenti preliminari sono stati condotti per valutare la densità ottimale di cellule da seminare, in modo da ottenere un rilascio citochinico adeguato alla sensibilità del saggio FBI non compromettendo la vitalità cellulare, e per individuare la concentrazione migliore di LPS utilizzato come controllo positivo. A questo scopo monociti THP-1, in fase esponenziale di crescita, sono stati seminati a diverse densità (0,25\0,5\1*106 cellule per ml) e per tempi differenti (12, 24, 48 e 72 ore) in assenza ed in presenza di LPS a concentrazioni stabilite (1\10μg per ml). Al termine delle suddette prove è stato deciso di seminare 0,25*106 cellule per ml di terreno di coltura, e di mantenerle in coltura per 24 ore. Inoltre, una soluzione di LPS (10μg/ml) incubata con le cellule per 24 ore a 37 °C è stata scelta come controllo positivo.
Cinque esperimenti indipendenti sono stati condotti mediante 24 ore di incubazione di monociti THP-1, in duplicato, con i campioni in PEtU-PDMS ed i materiali di riferimento. Al termine del periodo di incubazione, il terreno di coltura è stato conservato a -80◦C per la quantificazione della produzione citochinica.
I risultati, espressi in termini di media ± deviazione standard dei valori di IL-1β e IL-6, in pg/ml, sono riportati rispettivamente in Figura 6 e 7, mentre quelli di TNF-α ed IL-10 sono riportati in tabella 1 e 2 rispettivamente. Dall’analisi statistica dei dati si nota che i campioni processati mediante casting hanno indotto un rilascio di IL1-β paragonabile al controllo negativo ed ai materiali di riferimento, mentre, i campioni processati mediante spray con le percentuali di PDMS maggiori (30 e 50) hanno determinato un rilascio della stessa citochina pro-infiammatoria significativamente più basso rispetto al PEtU di riferimento e paragonabile al controllo negativo.
I risultati ottenuti per l’IL-6 sono analoghi a quelli ottenuti per l’IL-1β; i campioni processati mediante casting, infatti, hanno indotto un rilascio di IL-6 paragonabile ai materiali di riferimento ed al controllo negativo, invece, i campioni processati per spray con il 30 ed il 50 % di PDMS hanno determinato un rilascio della stessa citochina significativamente inferiore rispetto ad entrambi i RMs.
Per quanto concerne il rilascio di TNF-α e IL-10 è emerso che né la procedura di fabbricazione né la percentuale di PDMS influiscono in modo statisticamente significativo sui livelli di produzione citochinica monitorata. I risultati relativi al rilascio citochinico, in particolare di IL-1β e di IL-6, indicano che, solamente per il materiale processato mediante spray, maggiore è il contenuto di PDMS minore è la produzione citochinica monocitaria.
* *
F i g u r a 6 . Li vel l o di IL - 1 β prodo tta da cel lu le TH P-1 dopo 24 or e d i incubazione con i campioni in PEtU-PDMS processati mediante casting e mediante spray e con i materiali di riferimento. I dati sono riportati come media ± S.D. dei valori ottenuti in cinque esperimenti indipendenti. L’analisi statistica è stata effettuata con il t test di Student, (p< 0,01) * vs PEtU di riferimento. In te rl eu ch in a -1 β (p g/m L)
Procedura casting Procedura spray
33 12 26 12 19 7 7 45 16 20 14 14 0 10 20 30 40 50 60 70 80 14 PEtU-PDMS
PEtU-PDMS RMsRMs PEtU-PDMSPEtU-PDMS RMsRMs
PDMS PEtU LDPE PDMS PEtU LDPE ePTFE RMs controllo negativocontrollo negativo 10% 30% 50% 10% 30% 50% PEtU-PDMS * * 19 Procedura spray
F i g u r a 7 . Li v e ll o d i I L -6 prodo t t a d a cell u le THP-1 dopo 24 o r e d i incubazione con i campioni di PEtU-PDMS, processati mediante casting e mediante spray, e con i materiali di riferimento. I dati sono riportati come media ± S.D. dei valori ottenuti in cinque esperimenti indipendenti. L’analisi statistica è stata effettuata con il t test di Student, (p< 0,01) * vs
PEtU-PDMS
PEtU-PDMS RMsRMs PEtU-PDMSPEtU-PDMS RMsRMs
13 17 10 19 10 24 15 19 17 23 20 19 0 10 20 30 40 50 60 Procedura casting In te rl eu ch in a -6 (p g /m L) PDMS PEtU LDPE PDMS PEtU LDPE ePTFE RMs controllo negativocontrollo negativo 10% 30% 50% 10% 30% 50% PEtU-PDMS * *
T a b e l l a 1 . C o n c en tr a z io n i d i TNF- α ed IL-10, espresse i n pg /m l, ril a sciate nel terreno di coltura. La media ± S.D è calcolata sui dati ottenuti dall’incubazione di 24 ore di cellule THP-1, a contatto con i campioni in PEtU-PDMS processati per procedura casting ( ) e con i materiali di riferimento ( ), dei 5 esperimenti indipendenti.
T a b e l l a 2 . C o n c en tr a z io n i d i TNF- α ed IL-10, espresse i n pg /m l, ril a sciate nel terreno di coltura. La media ± S.D è calcolata sui dati ottenuti dall’incubazione di 24 ore di cellule THP-1, a contatto con i campioni in PEtU-PDMS processati per procedura spray ( ) e con i materiali di riferimento ( ), dei 5 esperimenti indipendenti.
4.1.4 Valutazione dell’adesione monocitaria
Al termine di 24 ore di incubazione delle cellule THP-1 con i campioni la valutazione quantitativa dell’adesione monocitaria è stata determinata, previa colorazione con Giemsa, mediante osservazione allo stereo-microscopio e successiva conta automatica computerizzata.
Esperimenti preliminari sono stati condotti per stabilire la procedura ottimale per ottenere il distacco delle cellule in sospensione o comunque non adese al materiale. A questo scopo, sono stati condotti esperimenti di incubazione di cellule THP-1 per 24 ore con i campioni nelle stesse condizioni. I campioni sono stati incubati, in basculazione con differenti soluzioni (PBS freddo/PBS EDTA) a diversi time points (1, 5 e 10 minuti) e sottoposti ad un numero differente di lavaggi. Al termine di queste prove preliminari è stato deciso di lavare i campioni 3 volte con 1 ml di PBS freddo per pozzetto, prima di procedere con la conta cellulare.
I dati, espressi in termini di Ia medio ± SD del numero di cellule presenti per mm2 di superficie del materiale, sono riportati in Figura 7. L’indice di adesione cellulare medio (Ia) è ottenuto contando in automatico, mediante il programma di elaborazione di immagine KS300, il numero medio di cellule aderenti ottenuto da 4 diversi campi microscopici scelti casualmente per ogni campione, nei 5 esperimenti indipendenti.
I valori di adesione ottenuti per i campioni processati per
casting sono risultati bassi (Ia ~ 5) e paragonabili a quelli
riscontrati per i materiali di riferimento, mentre, i campioni processati per spray ed il PEtU di riferimento determinano valori elevati di Ia (Ia ~ 80), e significativamente maggiori rispetto all’ePTFE (Figura 7). PDMS PEtU LDPE PDMS PEtU LDPE ePTFE RMs controllo negativocontrollo negativo 10% 30% 50% 10% 30% 50% PEtU-PDMS
F i g u r a 7 . Liv e ll o d i adesi o n e cell ulare m e d i a (I a) o ttenu t o i n segu it o a 24 ore di incubazione di cellule THP-1 con i campioni in PEtU-PDMS, processati mediante casting e mediante spray e con i materiali di riferimento. I dati sono riportati come media ± S.D. dei valori ottenuti in cinque esperimenti indipendenti. L’analisi statistica è stata effettuata con il t test di Student, (p< 0,01) * vs ePTFE di riferimento.
4 5 6 4 6 4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 7 92 82 94 79 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 In d ic e d i A de si o n e ( ce llu le /m m 2)
Procedura casting Procedura spray
PEtU-PDMS
PEtU-PDMS RMsRMs PEtU-PDMSPEtU-PDMS RMsRMs *
*
4.2 VALUTAZIONE DELL’IMMUNOCOMPATIBILITA’ IN CONDIZIONI DINAMICHE
4.2.1 Analisi morfologica dei campioni in PEtU-PDMS
In Figura 8 è mostrata una fotografia di una protesi vascolare in PEtU-PDMS processata per spray; i parametri di fabbricazione sono stati stabiliti in modo da ottenere protesi con una lunghezza di 10 cm, un diametro interno di 5 mm ed uno spessore medio di 0,6 mm.
a
Le protesi vascolari sono state realizzate processando due soluzioni di PEtU-PDMS a concentrazione differente in modo da ottenere una composizione a due strati nello spessore; in particolare, si può distinguere uno strato interno altamente poroso, noto in letteratura per favorire l’emocompatibilità delle protesi ottenuto con la soluzione di PEtU-PDMS allo 0,2% (p/v), e uno
A
5mm 5mm
Figura 8. A) Fotografia di una protesi vascolare in PEtU-PDMS; B) sezione trasversale della protesi vascolare (osservazione allo stereo-microscopio; ingrandimento originale 20X).
strato esterno denso e compatto, per conferire resistenza alle protesi, ottenuto con una soluzione al 2% (p/v).
L’analisi microscopica mediante osservazione allo stereo-microscopio, in seguito a colorazione con Nero Sudan, ha dimostrato la micro-porosità dello strato luminale interno confermata anche dall’analisi SEM, la quale ha rilevato la presenza di pori del diametro medio di ~ 100 μm (Figura 9 A e B).
4.2.2 Valutazione dell’attivazione piastrinica
Il dosaggio della β-TG, noto indice di attivazione piastrinica, è stato effettuato tramite un saggio ELISA sul PPP secondo il protocollo descritto da Ludlam e Cash nel 1976.
Allo scopo di determinare il rilascio plasmatico di β-TG sono stati eseguiti cinque esperimenti indipendenti in cui sangue anticoagulato umano è stato fatto circolare in un circuito all’interno di protesi in PEtU-PDMS con la stessa velocità di flusso indicativa
Figura 9. a) fotografia acquisita allo stereo-microscopio (I.O. 60X) e b) al SEM della superficie luminale di una protesi vascolare.
(100 ml/min) e per lo stesso intervallo di tempo di due ore. Al termine della circolazione in vitro, ad ogni valore relativo alla quantità di β-TG, espressa in ng per ml di PPP, è stato sottratto il valore basale.
I dati relativi al dosaggio della β-TG sono riportati in Figura 10. L’analisi statistica ha evidenziato che le protesi in PEtU-PDMS a più alto contenuto in PEtU-PDMS (30 e 50 %) inducono un rilascio di β-TG inferiore rispetto a quelle al 10 % di PDMS e significativamente minore rispetto alle protesi di riferimento.
I risultati indicano che la presenza di PDMS alle concentrazioni più alte influisce positivamente sull’emocompatibilità delle protesi, in particolare limitando la reazione di degranulazione piastrinica.
Tempo (min)
F i g u r a 1 0 . L a con cen tra z i on e p l asma tic a d i β -T G ( n g/m l ) è ri p o r tat a pe r ogni protesi analizzata. I dati per il basale e dopo due ore di circolazione sono riportati come media ± S.D. dei valori ottenuti in cinque esperimenti
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 0 120 PDMS PDMS 30% PEtU 50% 10% PDMS PDMS PDMS 30% PEtU 50% 10% PDMS β -t ro m b o g lo bu lin a (n g/ m l)
4.2.3 Quantificazione citofluorimetrica della produzione
citochinica monocitaria
La valutazione della produzione citochinica è stata eseguita mediante saggio FBI applicato alla citofluorimetria a flusso. Il saggio FBI è eseguito sul PPP ottenuto dal sangue anticoagulato prelevato prima e al termine degli esperimenti di circolazione in
vitro.
Ad ogni valore relativo alla quantità citochinica, espressa in ng/ml, misurata al termine della circolazione in vitro, è sottratto il valore basale. I valori di concentrazione plasmatica di IL-1β ed IL-6 ottenuti nei cinque esperimenti indipendenti sono riportati in Figura 11 e 12 rispettivamente mentre quelli di TNF-α e IL-10 sono riportati nella tabella 3. I dati hanno dimostrato che solamente le protesi con il 50 % di PDMS inducono un rilascio di IL-1β significativamente inferiore rispetto a protesi in PEtU di riferimento.
Al contrario, protesi con il 10 % e il 30 % di PDMS hanno dimostrato indurre valori della stessa citochina paragonabili a quelli del controllo. I valori di concentrazione plasmatica ottenuti per IL-6 confermano l’influenza del PDMS sulla produzione citochinica: protesi con un contenuto di PDMS maggiore (30 e 50 %) inducono un rilascio di IL-6 significativamente minore rispetto a protesi in PEtU. Solamente le protesi al 10 % hanno dimostrato indurre valori della stessa citochina paragonabili a quelli di controllo.
Per quanto concerne la produzione citochinica di TNF-α e IL-10 è emerso che né la procedura di fabbricazione né la percentuale di PDMS influiscono in modo statisticamente significativo sui livelli di produzione citochinica monitorata.
Dai risultati ottenuti emerge che il PDMS sembra limitare il processo infiammatorio, in particolare per la produzione di IL-1β e IL-6. Tempo (min) PDMS PDMS 30% PEtU 50% 10% PDMS PDMS PDMS 30% PEtU 50% 10% PDMS 0 30 60 90 120 150 180 210 0 120 In te rl eu ch in a 1 -β (pg/ m l)
F i g u r a 1 1 . La c once n t r azi one pl as m a tica di IL-1 β (pg / m l ) è r i por tat a per ogni protesi analizzata. I dati per il basale e dopo due ore di circolazione sono riportati come media ± S.D. dei valori ottenuti in cinque esperimenti indipendenti. L’analisi statistica è stata effettuata con il t test di Student, (p< 0,01) protesi con 50% di PDMS vs PEtU di riferimento.
PDMS PDMS 30% PEtU 50% 10% PDMS PDMS PDMS 30% PEtU 50% 10% PDMS In te rl e u ch in a -6 ( pg/m l)
F i g u r a 1 2 . L a con centr az ion e p l as ma tic a d i I L -6 (pg / ml) è r i por ta ta pe r ogni protesi analizzata. I dati per il basale e dopo due ore di circolazione sono riportati come media ± S.D. dei valori ottenuti in cinque esperimenti indipendenti. L’analisi statistica è stata effettuata con il t test di Student, (p< 0,01) protesi con 30 e 50% di PDMS vs PEtU di riferimento.
0 200 400 600 800 1000 1200 0 Tempo (min) 120
T a b e l l a 3 . C o n c en tr a z io n i d i TNF- α ed IL-10, espresse i n pg /m l, ril a sciate nel PPP. La media ± S.D è calcolata sui dati ottenuti, sottratti dei basali, in seguito a 2 ore di circolazione in vitro di sangue intero in protesi in PEtU-PDMS ( ) e in PEtU di riferimento ( ) di 5 esperimenti indipendenti.
