4. RISULTATI
4.1 Comparazione tra DQ e MGG per
l'identificazione dei MCs
L’analisi morfometrica preliminare condotta al fine di valutare le differenze tra la colorazione DQ e la colorazione MGG nel rilevare la presenza di MCs, ha permesso di ottenere una stima dei MCs presenti negli aspirati linfonodali colorati con le due tecniche. Il numero dei MCs è stato espresso in percentuale rispetto al totale delle cellule contate.
La media percentuale (LSM=media quadratica minima) di MCs ottenuta dal totale dei LNs esaminati è stata rispettivamente di 3,4 ± 2,86% per la colorazione MGG e di 2,7 ± 2,86% per la colorazione DQ.
Non sono state rilevate quindi differenze statisticamente significative tra le due diverse tecniche di colorazione (p=0,86).
4.2 Animali
L’indagine è stato condotta su un totale di 62 cani. Tale popolazione è risultata così costituita:
- 4 animali (6%) clinicamente sani (Gruppo 1);
- 31 animali (50%) con varie malattie infiammatorie di origine non neoplastica (Gruppo 2);
Agli animali appartenenti al Gruppo 2 sono state diagnosticate le seguenti malattie infiammatorie: dermatite in 14 soggetti (45%), leishmaniosi in 6 soggetti (20%), erlichiosi in 6 soggetti (20%), rickettsiosi in 2 soggetti (6%), linfoadenite che risponde alla Doxiciclina in 1 soggetto (3%), toxoplasmosi in 1 soggetto (3%) e poliartrite in 1 soggetto (3%). I cani appartenenti al Gruppo 3, e quindi con MCT cutaneo, sono stati suddivisi sulla base della stadiazione clinica: Sottogruppo 3.1 costituito da 5 animali (18%) con Stadio I della malattia, Sottogruppo 3.3 composto da 8 animali (30%) con Stadio II della malattia e da 10 animali (37%) con Stadio IV della malattia, in base alla stadiazione clinica descritta nella parte dei materiali e metodi. I 4 cani restanti appartenenti al Gruppo 3 (15%) avendo mostrato a livello dei LR occasionale presenza di MCs senza evidenza di metastasi a distanza e di conseguenza creando dubbi sulla stadiazione, sono stati inseriti in un gruppo distinto (Sottogruppo 3.2: Stadio I vs Stadio II della malattia). I dati relativi a ciascun Gruppo sono riportati in Tabella 3.
Nei paziente del Gruppo 2 e del Gruppo 3 i linfonodi drenanti erano tutti palpabili.
TABELLA 3
Descrizione dei casi
Gruppo 1: cani clinicamente sani
CASO LN
CAMPIONATO PATTERN MALATTIA
N° 33 Prescapolare Normale Normale N° 34, 35, 37 Popliteo Normale Normale
Gruppo 2: cani con malattie infiammatorie o infettive non neoplastiche
CASO LN
CAMPIONATO PATTERN MALATTIA
N° 2, 9 Popliteo Iperplasia reattiva Leishmaniosi N° 6 Popliteo Iperplasia reattiva Toxoplasmosi N° 8 Popliteo Iperplasia reattiva Erlichiosi e
meningite N° 14, 48 Popliteo Iperplasia reattiva Foruncolosi
interdigitale N° 16 Popliteo Iperplasia reattiva Rickettsiosi N° 17, 23 Prescapolare Iperplasia reattiva Erlichiosi N° 18, 24 Popliteo +
Sottolombare
Iperplasia reattiva Dermatite N° 21, 29 Mandibolare Iperplasia reattiva Dermatite N° 25 Prescapolare Iperplasia
plasmacellulare Leishmaniosi N° 26 Popliteo Iperplasia reattiva Poliartrite N° 27 Popliteo Iperplasia reattiva Piodermite,
pancreatite,diabete N° 10, 28, 43 Popliteo Iperplasia reattiva Erlichiosi
N° 30 Prescapolare Iperplasia reattiva Dermatite N° 32 Prescapolare Iperplasia reattiva Rickettsiosi N° 4 Popliteo Linfoadenite
neutrofilica Foruncolosi interdigitale N° 5, 46 Prescapolare Linfoadenite neutrofilica Leishmaniosi N° 7 Popliteo Linfoadenite neutrofilica Dermatite N° 31 Popliteo Linfoadenite neutrofilica Pannicolite N° 45, 62 Popliteo Dermatite eosinofilica Dermatite atipica N° 1 Popliteo Iperplasia plasmacellulare Leishmaniosi
N° 3 Prescapolare Iperplasia plasmacellulare Fistola perianale N° 22 Popliteo Iperplasia plasmacellulare Linfadenite che risponde alla doxociclina
Gruppo 3: cani con MCT canino
CASO LN
CAMPIONATO PATTERN MALATTIA
N° 50, 51, 52, 55 Popliteo Stadio I MCT N° 54 Prescapolare Stadio I MCT N° 44, 58 Prescapolare Stadio IV MCT N° 11 , 40 Popliteo Stadio I – Stadio II MCT N° 15, 36, 49, 61 Prescapolare Stadio II MCT N° 39, 41, 42, 60 Popliteo Stadio II MCT N° 12, 53 Prescapolare Stadio IV MCT N° 13, 20, 47, 56, 59 Popliteo Stadio IV MCT N° 19 Meseraico Stadio I – Stadio II MCT N° 37 Inguinale Stadio IV MCT N° 38 Inguinale Stadio I – Stadio II MCT
4.3 Risultati della valutazione citologica e dell’analisi
morfometrica nucleare
Sono stati esaminati citologicamente un totale di 62 LNs, al fine di stabilire la percentuale di MCs.
Il numero di MCs espresso come percentuale (LSM) rispetto al totale delle cellule contate per ciascun gruppo di animali è riportato in Tabella 4. La valutazione morfometrica dei parametri nucleari è stata effettuata da un totale di 14 LNs. I risultati sono riportati in Tabella 5.
Tra i parametri ottenuti dall’analisi quantitativa del nucleo, MNA è risultata essere significativamente più alta nei cani con evidenti metastasi ai LN (Sottogruppo 3.3)
MNA calcolato sui preparati linfonodali dei cani appartenenti al Sottogruppo 3.1 non ha mostrato risultati significativamente diversi da quelli ottenuti dall’esame dei MCs contenuti nei LNs di cani con malattie infiammatorie (Gruppo 2). I valore di MNA dei 4 cani che non hanno evidenziato chiare metastasi ai LR ma soltanto presenza occasionale di MCs (Sottogruppo 3.2), è risultato simile a quello conseguito dal Sottogruppo 3.3.
Anche il parametro MNP è risultato significativamente più elevato nel Sottogruppo 3.2 e nel Sottogruppo 3.3 rispetto al Gruppo 2 e nel Sottogruppo 3.1, con p<0.05.
Per quanto riguarda il fattore FF, differenze significative a p<0.05 sono state osservate tra il Sottogruppo 3.3 e il Sottogruppo 3.1, e tra il Sottogruppo 3.3 ed il Sottogruppo 3.2. Tuttavia, non vi era alcuna differenza significativa nei valori di FF ottenuti dal Gruppo 2 rispetto a quelli ottenuti dal Gruppo 3.
La valutazione eseguita mediante applicazione del test di effetto globale, ha mostrato differenze significative nei confronti del parametro nucleare LS (p=0.013). Tale risultato però non è stata confermata dal test di Tukey sui contrasti multipli.
Nel complesso la forma nucleare dei MCs dei cani appartenenti al Gruppo 2 e al Sottogruppo 3.1 tendeva ad essere rotonda, a differenza della forma dei nuclei dei MCs dei cani appartenenti al Sottogruppo 3.3 che tendeva ad essere ellittica.
Anche se NACV non ha evidenziato nessuna differenza significativa tra i Gruppi (p=0.56), tale parametro ha mostrato valori che tendevano ad essere progressivamente maggiori nei Sottogruppo 3.2 e Sottogruppo 3.3, rispetto al Gruppo 2 e al Sottogruppo 3.1.
TABELLA 4
MCs contati espressi come percentuale nel Gruppo 1 (animali sani), nel Gruppo 2 (cani con malattie non neoplastiche), nel Gruppo 3 (cani con MCT cutaneo). I Sottogruppi comprendono: Sottogruppo 3.1 cani senza metastasi ai LR, Sottogruppo 3.2 cani con presenza occasionale di MCs nei LR, Sottogruppo 3.3 cani con evidenti metastasi ai LR.
GRUPPO N° DI LNs % RISPETTO AL TOT DELLE CELLULE CONTATE RANGE LSM ES Gruppo 1 4 0,00B 10,72 0,0 Gruppo 2 31 0,01B 3,85 0,0 – 0,1 Gruppo 3 3.1 5 0,07B 9,59 0,1 – 0,3 3.2 4 2,4B 10,72 0,8 – 2,8 3.3 18 47,1A 5,05 0,4 – 98,86
A,B = le medie all’interno delle righe recanti i diversi esponenti sono diverse a p<0,05 LN = linfonodo, LSM = media quadratica minima, ES = errore standard
TABELLA 5
Risultati della citomorfometria nucleare* GRUPPO N° LNs analizza ti N° MCs analizza ti MNA (pixel) MNP (pixel) FF RAPPOR -TO LS NACV (%) LSM ES LS M ES LS M ES LSM ES LS M ES Gruppo 2 6 16 419,9 B 75,28 73,4B 4,70 0,97A,B 0,01 1,16 0,04 17,3 5,79 Gruppo 3.1 3 24 378,7 B 74,77 69,5B 4,67 0,97A 0,01 1,12 0,04 16,5 7,10 Gruppo 3.2 4 65 700,8 A 25,77 96,5A 1,00 0,96B 0,00 1,19 0,01 23,5 5,02 Gruppo 3.3 5 159 713,9 A 16,03 94,3A 1,61 0,94B 0,00 1,22 0,01 25,9 4,49
A,B= le medie all’interno delle righe recanti i diversi esponenti sono diverse a p<0,05
*per la descrizione dei gruppi riferirsi alla Tabella 5
LN = linfonodo, LSM = media quadratica minima, ES = errore standard, MC = mastociti, MNA = area nucleare media, MNP = perimetro nucleare medio, Rapporto LS = rapporto tra lunghezza maggiore e minore del diametro del nucleo, FF = fattore di forma nucleare medio (perimetro2 / 4 π area), NACV = coefficiente di variazione dell’area nucleare
4.4 Correlazione tra analisi morfometrica e risultati
Al momento della conclusione delle ricerca, 3 dei 4 cani costituenti il Sottogruppo 3.2 sono morti a causa della diffusione metastatica e soltanto 1 è rimasto in vita.
Questo è sopravvissuto nonostante mostrasse evidenti metastasi alla milza, al fegato ed al midollo osseo ed è attualmente in corso di trattamento con chemioterapia adiuvante. Le metastasi hanno iniziato a svilupparsi dopo 2, 4 e 5 mesi dalla rimozione chirurgica del MCT cutaneo.