I MICROORGANISMI e il

I MICROORGANISMI e il loro AMBIENTE NATURALE

In natura le cellule vivono in associazione con altre cellule

L’insieme di più popolazioni che occupano lo stesso habitat e sono metabolicamente correlate

CONSORZIO MICROBICO POPOLAZIONI

INSIEME DI NUMEROSI ORGANISMI DELLA STESSA SPECIE

Composte da gruppi di cellule che derivano da divisioni cellulari successive a partire da una singola cellula parentale

Si definisce habitat il luogo in cui una popolazione microbica vive

sono costituite da diverse popolazioni microbiche (consorzi) che interagiscono tra di loro in un

determinato ambiente.

COMUNITA’ MICROBICHE

I componenti e il num di cellule che costituiscono una comunità microbica dipendono dalle risorse e dalle condizioni presenti in quel determinato habitat

ECOSISTEMA

è costituito dagli organismi viventi unitamente ai costituenti chimici e fisici dell’ambiente di cui

fanno parte

Le popolazioni in una comunità microbica interagiscono tra loro in modo benefico e/o dannoso In molti casi vi è cooperazione: per esempio i prodotti di scarto delle attività metaboliche

di alcune cellule possono fungere da nutrienti per altre cellule

Giovanni Vallini © 2006

I MICROORGANISMI e il loro AMBIENTE NATURALE

Un ECOSISTEMA è controllato in modo significativo dalle TRASFORMAZIONI

MICROBICHE

I microorganismi, conducendo i loro processi metabolici, rimuovono nutrienti dall’ambiente circostante.

Allo stesso tempo, liberano nell’ambiente i loro prodotti di scarto

Nel tempo, un ECOSISTEMA gradualmente cambia, sia CHIMICAMENTE che FISICAMENTE

attraverso le trasformazioni microbiche dei nutrienti

ECOLOGIA MICROBICA studio dei microrganismi

nei loro habitat naturali

METODI per l’ANALISI dei MICROORGANISMI e delle COMUNITA’ MICROBICHE

Metodi

CULTURE-DEPENDENT CULTURE-INDEPENDENT

Permettono l’ISOLAMENTO dei microrganismi mediante l’impiego

di terreni selettivi specifici per la crescita seguito da una

CARATTERIZZAZIONE mediante saggi fisiologici e metabolici

Tecniche che prescindono dalla coltivabilità di un microrganismo.

Consentono di monitorare la

COMPOSIZIONE e le DINAMICHE di popolazione delle comunità microbiche presenti in varie matrici (acqua, suolo, reflui, alimenti etc.) senza ricorrere a

isolamenti preventivi

convenzionali molecolari

Permettono di analizzare le caratteristiche biochimiche e genetiche delle cellule che compongono la comunità

Metodi MICROSCOPICI

Le tecniche molecolari permettono la caratterizzazione sia della frazione coltivabile che di quella non coltivabile presente in un campione ambientale. Con le tecniche di coltivazione standard è invece possibile identificare solo quei microorganismi capaci di crescere su determinati terreni selettivi

La quantità di campione necessaria per lo studio della comunità microbica utilizzando tecniche molecolari è minore rispetto a quella necessaria per l’approccio classico

Solo con le tecniche culture-dependent è possibile avere a disposizione il microorganismo isolato per studi di carattere fisiologico e metabolico. È importante cercare di ottimizzare le tecniche di pre-arricchimento e arricchimento selettivi per riuscire a recuperare le popolazioni microbiche meno dominanti, stressate e non coltivabili, che sono presenti a bassa carica

METODI CULTURE-DEPENDENT

Costituiscono le cosiddette ‘procedure standard’ di identificazione dei microorganismi

Prevedono: 1) ISOLAMENTO in COLTURA PURA

2) CARATTERIZZAZIONE fenotipica degli isolati ottenuti sulla base di caratteristiche morfologiche , biochimiche e della composizione chimica cellulare

LIMITI

• Questo approccio non è applicabile indifferentemente a qualsiasi specie microbica. Necessita quindi di essere adattato e ottimizzato di volta in volta sulla base della matrice (ambientale e/o alimentare) da analizzare e dei ceppi microbici in studio.

• Le tecniche proprie della tassonomia fenotipica forniscono risultati a volte incerti e di difficile interpretazione

• I microorganismi coltivabili e quindi isolabili in una matrice rappresentano solo una parte dell’intera comunità microbica

Per esempio: in una matrice ambientale i coltivabili sono <

10% del totale

ISOLAMENTO DI CEPPI MICROBICI IN COLTURA PURA

Anche su mezzo di crescita ottimizzato risulta isolabile al massimo il 20%, in media la frazione isolabile risulta compresa tra 1%-10%

CONDIZIONI COLTURALI NON

ADEGUATE

VITALITA’ del microorganismo da

isolare

Vi sono microrganismi che su determinati terreni di coltura non attecchiscono o crescono molto lentamente

Vi sono microrganismi che in condizioni ambientali sfavorevoli entrano in uno stato di metabolismo ridotto

VNC – “non coltivabili ma vitali”

(viable but not cultivable)

Giovanni Vallini © 2006

LA COLTIVAZIONE DEI BATTERI

I microorganismi quando crescono su un terreno di laboratorio sono chiamati COLTURA

I MEZZI SU CUI VENGONO COLTIVATI I MICROORGANISMI VENGONO DETTI TERRENI DI COLTURA

• Con i terreni di coltura si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microorganismo che si desidera coltivare.

• Il terreno prima della semina deve essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto.

• Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione del terreno ad opera dei batteri presenti nell’ambiente

I TERRENI DI COLTURA – IMPIEGHI

• conteggio dei microorganismi presenti in una matrice;

• isolamento dei microorganismi;

• mantenimento in coltura pura;

• identificazione e studio delle caratteristiche biochimiche;

• coltivazione per la produzione di antibiotici, enzimi, tossine, antisieri, vaccini, colture starter;

• valutazione dell’attività di prepararti farmacologicamente attivi (per es: antibiotici, ricerca di sostanze inibenti)

IL CAMPIONAMENTO

IL CAMPIONE è spesso DISOMOGENEO!!

Le cellule presenti in un singolo grammo di matrice NON SONO UGUALMENTE DISTRIBUITE nello spazio della matrice (aggregati)

Numerosi REPLICATI

Raccolti in punti diversi dell’ambiente in esame

1. OMOGENIZZAZIONE

2. DISTACCO DELLE CELLULE MICROBICHE DALLA MATRICE

lavaggi con soluzioni saline che alterano le interazioni elettrostatiche tra la parete batterica e la matrice stessa

3. La sospensione microbica così ottenuta viene quindi utilizzata per l’isolamento o la quantificazione

L'analisi di un piccolo campione prelevato da una massa di grandi dimensioni ha senso soltanto se il campione è rappresentativo di tutta la massa e ne rispecchia quindi la composizione media.

ISOLAMENTO E COLTIVAZIONE DEI BATTERI

Isolamento: la separazione di un dato individuo (cellula) dagli altri individui (popolazione mista naturale di cellule)

Coltivazione: moltiplicazione del singolo individuo (cellula) su un

substrato adatto alla crescita così da ottenere alla fine una popolazione di cellule appartenenti ad un’unica specie.

COLTURA PURA o AXENICA

Per coltura pura si intende l’insieme delle cellule che si ottengono dalla riproduzione di una sola cellula iniziale

METODI PER LA QUANTIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI

DIRETTI

INDIRETTI

 conta al microscopio ottico

 conta al microscopio a fluorescenza (FISH, colorazioni)

 conta su piastra

 MPN

 PCR quantitativa

 Biomassa

 attività microbica

METODI PER LA QUANTIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI

CONTA SU PIASTRA

Partendo dalla matrice ambientale preparo una sospensione Vengono allestite diluizioni seriali della sospensione

Opportune diluizioni seriali vengono seminate su opportuni mezzi di crescita:

Minimi, ricchi, arricchiti, selettivi

Sulla base della diluizione piastrata e del volume piastrato posso risalire al numero di UFC (Unità Formanti Colonia) presenti per grammo di matrice

M (UFC)= n * F

V

M= num di m.o. per ml

n = num di colonie cresciute V = volume seminato

F = fattore di diluizione

ISOLAMENTO DIRETTO

Sospensione di un’aliquota di matrice in soluzione fisiologica (0.9% NaCl)

-L’ottenimento dei ceppi avviene a seguito di semina su piastra contenente mezzo non selettivo agarizzato

-i ceppi ottenuti vengono successivamente testati per la loro capacità di crescere in presenza del contaminante di interesse

L’ottenimento di ceppi in coltura pura avviene dopo strisci successivi di colonie singole a partire dalla piastra iniziale

COLTURA PURA

MANTENIMENTO

degli isolati Gli isolati devono essere mantenuti su mezzi di crescita in presenza del contaminante

METODI PER L’ISOLAMENTO DI CEPPI

BATTERICI in COLTURA PURA

METODI PER L’ISOLAMENTO DI CEPPI BATTERICI in COLTURA PURA

COLTURA DI ARRICCHIMENTO

Sospensione di un’aliquota della matrice in mezzo di crescita liquido selettivo, contenente il contaminante di interesse.

Fattori importanti da considerare:

-Concentrazione del contaminante

-Solubilità in acqua del contaminante: possono essere utilizzati solventi organici miscibili in acqua DMSO, DIMETILFORMAMMIDE, ALCOOL ETILICO, ACETONE (conc del solvente < 1% vol/vol)

-Il contaminante può essere aggiunto anche per evaporazione

-Preparazione di soluzioni stock sterilizzate per filtrazione -Tempo di incubazione

L’ottenimento dei ceppi selezionati avviene a seguito di semina su piastra contenente mezzo selettivo agarizzato

Fa ricorso all’utilizzo di terreni selettivi in grado di sostenere la crescita delle differenti specie microbiche aventi necessità trofiche distinte

CARATTERIZZAZIONE MORFOLOGICA

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE

MACROSCOPICHE

MICROSCOPICHE

Colore e forma delle colonie - Forma delle cellule batteriche (cocchi, bacilli, spirilli)

- Dimensione cellulare - Colorazione di Gram MICROSCOPIA OTTICA

MICROSCOPIA ELETTRONICA TEM (microscopia elettronica a trasmissione

SEM (microscopia elettronica a scansione)

Risulta estremamente difficile identificare ogni componente di una

comunità microbica attraverso la semplice osservazione al microscopio.

Inoltre molti gruppi microbici presentano caratteri fenotipici non specifici e quindi non utilizzabili ai fini della loro identificazione

STUDIO DELLA MORFOLOGIA

NUTRIENT AGAR SLANT

• quantità di crescita: nessuna, lieve, moderata, abbondante

• colore: il colore può essere presente nella biomassa batterica

(Serratia marcescens),oppure diffondere nel mezzo facendolo colorare (Pseudomonas fluorescens)

• opacità: dipende dalla quantità di biomassa prodotta: opaco, trasparente, traslucente

• forma: la strisciata su uno slant può dare crescita di diversa forma a seconda del tipo di batterio

STUDIO DELLA MORFOLOGIA

NUTRIENT AGAR PLATE

CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA

I saggi biochimici forniscono un maggior numero di informazioni rispetto ai saggi morfologici,consentendo quindi una più facile identificazione

Misurano: - capacità di utilizzare diverse fonti di carbonio

- capacità di condurre determinate reazioni enzimatiche (ossidasi, catalasi)

Alcuni KIT diagnostici

per microbiologia API (BioMerieux) BIOLOG

CRYSTAL (Becton-dickinson) AUXACOLOR (Sanofi Pasteur) Svantaggi:

1. Le proprietà biochimiche possono essere instabili e suscettibili alle

variazioni dell’ambiente circostante (es. temperatura, pH, età della coltura, concentrazione di O₂)

2. Può risultare difficile distinguere microrganismi appartenenti a specie diverse che presentano lo stesso profilo biochimico

3. I saggi biochimici sono immediati ma proprio per questo è facile interpretare in maniera errata l’esito della reazione

4. È necessario mettere a punto saggi biochimici sempre più sensibili in grado di discriminare nuove specie microbiche

È tra le più efficienti e per questo è molto utilizzata

ANALISI DEGLI ACIDI GRASSI (FAME)

METODO BIOCHIMICO CHE SI BASA SULLA SEPARAZIONE GAS

CROMATOGRAFICA DEGLI ESTERI METILICI DEGLI ACIDI GRASSI

Gli acidi grassi rappresentano un frazione relativamente costante della biomassa cellulare

Esistono profili di acidi grassi caratteristici e distintivi dei principali gruppi tassonomici di microrganismi

Nel caso in cui tale analisi sia effettuata su campione ambientale, una variazione del profilo in acidi grassi può essere dovuto a un cambiamento nella composizione

tassonomica della comunità microbica

METODI CULTURE-INDEPENDENT

1. SEGUIRE L’EVOLUZIONE E IL COMPORTAMENTO DI UN CONSORZIO MICROBICO NEL TEMPO (MONITORAGGIO DIACRONICO)

2. VALUTARE LA SICUREZZA MICROBIOLOGICA TRAMITE MONITORAGGIO in situ DI MICROORGANISMI PATOGENI

3. RICOSTRUIRE L’EFFETTIVA COMPOSIZIONE DI UNA COMUNITA’

MICROBICA

4. MONITORARE in situ LA PERSISTENZA DI UN DETERMINATO INOCULO BATTERICO (bioaugmentation)

TECNICHE MOLECOLARI

Permettono di rilevare sia microorganismi presenti a basse concentrazioni che microorganismi non coltivabili in laboratorio

Le tecniche molecolari sviluppate per il monitoraggio della dinamica delle comunità microbiche possono essere

raggruppate essenzialmente in due categorie:

A. Tecniche che si basano sull’analisi delle sequenze di DNA indipendentemente da conoscenze pregresse circa la struttura della comunità microbica di interesse. In particolare le tecniche che si basano sulla PCR si sono rivelate un mezzo estremamente veloce ed efficace per l’identificazione, la caratterizzazione e il monitoraggio dei microorganismi in generale e dei batteri in particolare

B. Tecniche di ibridazione che impiegano sonde molecolari, utilizzate quando esistono informazioni pregresse riguardo alla comunità microbica di interesse

PRINCIPALI TECNICHE DI INDAGINE MOLECOLARI

TECNICHE DI PCR FINGERPRINTING

In generale le metodiche molecolari basate sull’utilizzo della PCR permettono di distinguere entità microbiche strettamente correlate dal punto di vista

genetico attraverso l’ottenimento di specifiche impronte molecolari (molecular fingerprinting)

PCR con primers per marker genici di particolare interesse filogenetico

16S rRNA, 23S rRNA, regione intergenica 16S-23S

18S e 26S rRNA

rRNA RIBOSOMALI

I rRNA possono essere considerati dei veri e propri CRONOMETRI MOLECOLARI

perché caratterizzati dalla presenza al loro interno di zone più o meno conservate,soggette a differente variabilità durante il

processo evolutivo.

L’informazione contenuta nei rRNA fa si che il sequenziamento dei geni (rDNA) che codificano per le suddette macromolecole permetta l’individuazione,su base genetica, di generi e specie, anche nel caso di batteri di difficile classificazione

Molecole essenziali per la vita delle cellule Costituiscono la parte non proteica dei ribosomi

Elementi chiave della sintesi proteica

IL GENE 16S rRNA

LA SEQUENZA DEL GENE CHE CODIFICA PER IL16S rRNA NEI MICROORGANISMI PROCARIOTI (EUBATTERI E

ARCHEBATTERI) SI E’ RIVELATA UN OTTIMO STRUMENTO TASSONOMICO

 È una sequenza universale tra i batteri

 Non è soggetta a trasmissione orizzontale

 Presenta regioni conservate e regioni variabili intersperse discriminanti le diverse specie batteriche

Le regioni al 5’ e 3’ del 16S rDNA sono fortemente conservate mentre quelle interne presentano una maggiore variabilità.

I primers per le reazioni di PCR possono essere disegnati su tutte e due le regioni fornendo informazioni differenti:

-Se disegnati al 5’ e 3’ permettono amplificazione e sequenziamento di regioni conservate che consentono l’identificazione del genere

-Se disegnati sulle regioni ipervariabili è possibile ottenere anche l’identificazione della specie

RDP – Ribosomal Database Project – allineamento e identificazione

ARDRA – Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

Consiste nello studio dei profili elettroforetici ottenuti dopo digestione con enzimi di restrizione della sequenza di 16S rDNA ottenuta mediante PCR

Tecnica efficace, veloce, semplice ed economica per

l’identificazione della composizione di comunità microbiche complesse

• Permette analisi simultanea di un elevato numero di microorganismi

• Fornisce importanti informazioni sulle popolazioni microbiche presenti in ambienti differenti descrivendo il loro grado di biodiversità e il loro comportamento nel tempo

• Riesce a discriminare i microorganismi a livello di specie PCR-RFLP

ARDRA – Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

L’ARDRA può essere utilizzata per lo screening di microorganismi coltivabili e non coltivabili

 Per ceppi microbici coltivati:

1. Isolamento dei batteri dall’ambiente naturale mediante le tradizionali tecniche di coltura

2. Amplificazione del 16S/18S rDNA dei singoli isolati via PCR 3. Digestione degli ampliconi ottenuti mediante l’impiego di

endonucleasi

4. Separazione elettroforetica dei prodotti della digestione per ciascun amplicone e ottenimento di profili elettroforetici tipici (impronta) per ciascun amplicone digerito

5. Suddivisione dei profili ottenuti per ciascun amplicone in gruppi definiti OTU (Operational Taxonomic Units)

6. Sequenziamento del 16S/18S rDNA per il capostipite di ogni OTUs

7. Allineamento delle sequenze ottenute con quelle presente in banca dati mediante programma BLAST

8. Assegnazione dell’appartenenza a genere e specie Su 16S/18S/26S

COSTRUZIONE DI LIBRARY di 16S/18S/26S rDNA

1. Estrazione del DNA totale dalla matrice ambientale di interesse 2. Amplificazione dell’intero gene16S/18S rDNA o di una regione

interna di interesse

3. Inserimento del gene in vettore di clonaggio (pGEM, pBS) e ottenimento di un numero di cloni compreso tra 100 e 200 4. Screening dei cloni ottenuti mediante analisi RFLP sull’inserto

(metodica ARDRA)

 Per ceppi microbici non coltivati:

CLONAGGIO E SEQUENZIAMENTO DEL 16S/18S rDNA

Profili ARDRA

ottenuti dagli isolati da matrice

ambientale

100bp 1kb

PbIsol 1 2 3 4 5 6 7 8

PbIsol 1 2 3 4 5 6 7 8

100bp 1kb

AluI

HhaI

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

Tecnica comunemente impiegata per studi di ecologia microbica È UNA TECNICA SEPARATIVA ELETTROFORETICA CHE PERMETTE DI IDENTIFICARE SINGOLE VARIAZIONI DI

SEQUENZA IN UN FRAMMENTO DI DNA

1. Estrazione del DNA totale dalla matrice ambientale

2. Amplificazione di regioni ipervariabili del 16S o altri geni codificanti per rRNA

3. Separazione elettroforetica su gel di poliacrilammide in

presenza di un denaturante chimico(urea e formammide)

La separazione si ottiene sfruttando la diversa mobilità elettroforetica, su gel di poliacrilammide contenente un gradiente lineare di denaturante, di molecole di DNA a doppio filamento di medesima lunghezza ma differente sequenza nucleotidica

Come avviene la separazione elettroforetica

Frammenti con sequenze diverse possiedono profili di denatuazione differenti e cessano di migrare lungo il gel in corrispondenza di posizioni non uguali

La denaturazione dei frammenti di DNA procede per domini di melting ovvero stretch di paia di basi aventi la stessa temperatura di denaturazione (T_m).

Una volta che il dominio avente la temperatura di denaturazione più bassa raggiunge raggiunge il punto nel gel a cui corrisponde la sua T_m, si assiste al passaggio da una conformazione a elica ad una conformazione parzialmente svolta del frammento di DNA

ARRESTO DELLA MIGRAZIONE DELLA MOLECOLA IN QUEL DETERMINATO PUNTO DEL GEL

Quale tipo di informazione si ottiene

L’analisi PCR-DGGE fornisce una serie di profili elettroforetici con una distribuzione caratteristica di bande, ciascuna riconducibile ad una specie batterica, descrivendo nel suo complesso la struttura tassonomica e

il grado di diversità della comunità microbica associata alla matrice ambientale in studio

I primers utilizzati

All’estremità 5’ del primer forward viene aggiunto un clamp (stringa di basi nuceotidiche) in GC di circa 30-40 paia di basi, caratterizzato da una T_m più elevata rispetto a qualsiasi altra regione del frammento del DNA 16S amplificato.

Il GC-clamp quindi funge da dominio ad alta temperatura di melting impedendo così la completa dissociazione del filamento di DNA in molecole a singolo filamento

Questa sequenza viene co-amplificata nella reazione di PCR e incorporata nei frammenti

LA DGGE VIENE CONSIDERATA UN POTENTE STRUMENTO IN GRADO DI MONITORARE ILCOMPORTAMENTO DELLE COMUNITA’

BATTERICHE A SEGUITO DI CAMBIAMENTI AMBIENTALI IN QUANTO POSSONO ESSERE ANALIZZATI SIMULTANEAMENTE MOLTI

CAMPIONI COLLEZIONATI A DIVERSI INTERVALLI DI TEMPO, COSA CHE NON PUO’ ESSERE FATTA ALTRETTANTO AGEVOLMENTE CON

PROCEDIMENTI DI CLONAGGIO

• conoscere la composizione di una comunità microbica complessa

• seguire nel tempo l’evoluzione di una comunità microbica, per esempio a seguito di un intervento di bonifica o a causa di una pressione sellettiva esercitata da un agente contaminante

• monitorare la persistenza di alcuni ceppi microbici all’interno di una comunità complessa a seguito di inoculo massivo

(bioaugmentation)

• monitorare la presenza di genotipi di interesse all’interno della comunità microbica e la loro evoluzione nel tempo

Per conoscere la composizione di una comunità microbica complessa:

 le bande caratteristiche dei profili possono essere tagliate da gel e successivamente sequenziate per avere una correlazione filogenetica dei membri della comunità microbica

1. Taglio delle bande maggiormente rappresentative 2. Eluizione della banda da gel

3. Ri-amplificazione del frammento di interesse

4. Sub-clonaggio del frammento in un opportuno vettore 5. Sequenziamento e confronto in banca dati

 il profilo DGGE può essere ibridato con sonde gruppo- specifiche per determinare la presenza di una specifica popolazione batterica

DG-DGGE (Double Gradient –

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

Il doppio gradiente è costituito dal gradiente chimico e da un gradiente di porosità (% di poliacrilammide)

La presenza del gradiente in porosità aumenta il grado di risoluzione delle singole bande

Il gradiente in porosità viene realizzato parallelamente a quello di denaturante

RT-DGGE (Reverse Trascriptase – DGGE)

In questa variante migrano nel gel di poliacrilammide i cDNA derivanti dalla retrotrascrizione dell’RNA estratto dal campione Questa analisi fornisce importanti informazioni sulla vitalità dei microrganismi che compongono la comunità microbica di

interesse

TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis)

In questo caso il gradiente non è costituito da un agente chimico ma dalla temperatura. Un apposito dispositivo infatti crea un

gradiente di temperatura nello spazio.

Gli ampliconi ottenuti con PCR vengono ancora una volta separati sfruttando la loro diversa Tm

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

LIMITI

• La DGGE è in grado di evidenziare solo gli amplificati ottenuti dalle specie predominanti presenti nella comunità, infatti non è possibile ottenere la separazione di tutti i frammentidi16S rDNA (o di altri geni target)ottenuti dall’intera gamma di microorganismi presenti all’interno di una matrice complessa

Numerosi studi hanno mostrato che solo le popolazioni batteriche rappresentanti l’1% o aliquote maggiori della comunità microbica possono essere evidenziate mediante

PCR-DGGE

• Con la DGGE è possibile separare solo frammenti di piccole dimensioni,fino a 500 bp

• spesso si osserva la migrazione nella stessa posizione di

frammenti di DNA di diversa sequenza ma con comportamento di melting molto simile che rende difficile il recupero di essi dal gel di poliacrilammide

D1 D2 D3 G H

I II III I II III

E1 E2 E3 F1 F2 F3

I II III I II III I II III I II III I II III I II III I II III