1. Inibitori cdk9
Gli inibitori chinasi ciclina-dipendenti 9 (CDK9) come DRB, il flavopiridolo, e la
roscotivina inibiscono la precoce elaborazione e trascrizione di rRNA. L’inibizione della trascrizione avviene inibendo la fase di allungamento della trascrizione catalizzata
da Pol I. Il blocco della trascrizione e l’elaborazione precoce di rRNA conduce alla
disintegrazione e la delocalizzazione delle proteine nucleolari come nucleofosmina.
57
2. 5-Fluorouracile
Il farmaco antitumorale 5-fluorouracile, un analogo pirimidinico, è metabolizzato
attivamente nella cellula a monofosfato fluorodeossiuridina (FdUMP), trifosfato
fluorodeossiuridina (FdUTP) e trifosfato fluorouridina (FUTP). I metaboliti deossi
provocano danni al DNA principalmente attraverso l'inibizione della timidilato sintetasi
da parte di FdUMP. Inoltre, gravi danni a RNA si verificano a causa di
un’incorporazione di FUTP in varie forme di RNA, che porta alla interruzione della loro elaborazione e delle funzioni vitali. In particolare l’elaborazione finale del rRNA nel nucleolo è inibita, portando ad uno stress nucleolare, ad un'alterazione della struttura
nucleolare, e all'attivazione dell’apoptosi p53-mediata.
3. Farmaci anti-infiammatori non steroidei
L'efficacia dei farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS) come agenti
antitumorali nei tumori del colon-retto, negli ultimi anni ha suscitato numerosi studi tesi
ad approfondire la conoscenza del loro meccanismo cellulare. Nel caso dell'aspirina,
sulindac, sulindac solfone, e indometacina, viene attivato il percorso di segnalazione
NF-kB. NF-kB, è un eterodimero dei polipeptidi p50 e RelA (p65), che regola
l'espressione genica, sia per quanto riguarda la crescita cellulare sia i percorsi
apoptotici. Aspirina, sulindac, sulindac solfone, e indometacina provocano lo
58
nei tumori colonrettali. Tali risposte sono state dimostrate dalla colocalizzazione di
RelA con la fibrillina o la nucleolina utilizzando la microscopia confocale associata a
tecniche immunocitochimiche.
4. Avrainvillamide
E’ un alcaloide naturale, (+)-avrainvillamide, che innesca processi antiproliferativi e apoptotici nelle cellule. L'alcaloide è stato contrassegnato in modo fluorescente con una
porzione dansyl in uso nella microscopia a fluorescenza. Il composto è stato trovato
accumularsi nei nucleoli e nel citoplasma del cancro cervicale HeLa-S3 e nelle cellule
umane tumorali epiteliali del seno T-47D. Inoltre, la co-localizzazione è osservata
mediante la fluorescenza della nucleofosmina, una proteina nucleolare espressa in molti
tumori, correlata alla tumorigenesi. La nucleofosmina, che si trova principalmente nel
GC del nucleolo, ha mostrato funzioni che comportano la stimolazione della
trascrizione rDNA, il trattamento di pre-rRNA, sia come modulatore positivo che
negativo di apoptosi mediata da p53 a seconda del tipo di cellula e di stimolo. Studi più
recenti hanno dimostrato che il composto è in grado di legarsi all'atomo di zolfo di
Cys275 nella nucleofosmina, il che potrebbe spiegare la sua co-localizzazione e i suoi
59
5. Complesso europio-azatioxantone
Grazie alle loro proprietà fotofisiche favorevoli, i complessi lantanidi (III) sono
particolarmente adatti come sonde molecolari. Se dotati di una frazione sensibilizzante
sufficiente per superare la loro bassissima capacità di assorbimento molare, questi
complessi metallici sono in grado di produrre strette bande spettrali e alti rapporti
segnale/rumore nelle spettroscopie ottiche. Un tale complesso, come quello EuIII con
una porzione sensibilizzante azatioxantone , pare sia capace di localizzare i nucleoli
delle cellule. Questo complesso ha dimostrato di non essere citotossico a 100
micromoli, di entrare nelle cellule con mezzi diversi dall’endocitosi, e di co-localizzare mediante il colorante SYTO-RNA-Select (vedi sotto), rendendolo una sonda ideale per
la localizzazione nucleolare. Il complesso è stato testato in NIH 3T3 (fibroblasti
standard), cellule HeLa (cellule di carcinoma cervicale umano endoteliale) e cellule
HDF (fibroblasti cutanei umani non trasformati). Nelle cellule NIH 3T3, l'intensità di
fluorescenza nel nucleolo è risultata essere tre volte superiore a quella nel citoplasma.
60
6. Naftalene diimide
I derivati del naftalene diimide sono stati sintetizzati e testati per verificare la selettività
G-quadruplex, l'inibizione della telomerasi, la senescenza, e la localizzazione
intracellulare. I ligandi tetra-sostituiti mostrano una notevole stabilizzazione G-
quadruplex e una maggiore selettività al DNA duplex rispetto ai derivati tri-e di-
sostituiti. Poiché i derivati tetra-e tri-sostituiti sono intrinsecamente fluorescenti, gli
esperimenti di localizzazione sono stati completati con la microscopia confocale nelle
cellule di carcinoma mammario MCF-7. Dei derivati che mostrano una localizzazione
esclusivamente nel nucleo, il loro accumulo è principalmente stato osservato nel
nucleolo. I naftalene diimide che si localizzano nel nucleolo mostrano dei valori di
IC50 nel range nanomolare delle cellule del carcinoma del polmone A549.
7. SYTO-RNA Select
SYTO-RNA Select è un esclusivo colorante della cianina cellula-permeabile che
assume una colorazione molto intensa nei nucleoli. Mostra una maggiore fluorescenza
verde quando si lega all'RNA rispetto al DNA e alle proteine. L'intensità di
61
di circa 2,5 volte maggiore rispetto a quella del nucleo e circa 10 volte rispetto al
citoplasma.
8. UNBS1450
UNBS1450, un cardenolide semi-sintetico, è capace di modificare la forma e la
localizzazione delle proteine del nucleolo nelle cellule tumorali umane. Confrontano
l'organizzazione nucleolare di cellule trattate con 100 nm UNBS1450 tramite
l’immunofluorescenza, nelle cellule polmonari umane e nei fibroblasti normali non è stato visualizzato alcun cambiamento, mentre nei carcinomi pancreatici DU145 e PC-3 i
cambiamenti sono stati marcati nella organizzazione nucleolare. In accordo con questa
osservazione, i livelli di espressione del fattore di legame up-stream (UBF)
diminuiscono notevolmente nell'arco di 24 h nelle cellule PC-3. UNBS1450 mostra un
valore nanomolare basso IC50 nelle cellule PC-3, e un miglioramento di 100 volte circa
rispetto all’oxaliplatino, all’irinotecano e l’etoposide. In vivo, i topi affetti dal tumore PC-3 mostrano un aumento del tasso di sopravvivenza dal 36 al 77% quando viene loro
iniettato a 10 e 20 mg kg-1 i.p., rispettivamente cinque iniezioni alla settimana per sei
settimane.
62
9. Nanoparticelle
Le nanoparticelle (NP) sono attualmente in fase di sviluppo per una varietà di
applicazioni differenti comprese quelle in campo biomedico. Recenti studi suggeriscono
che alcune NP possono traslocare verso il nucleo, di tanto in tanto verso il nucleolo. Poli
(etilenglicole) rivestito da nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNTs) sono stati
etichettati attraverso la fluoresceina, e il loro assorbimento e distribuzione cellulare
monitorato da microscopia a fluorescenza time-lapse. I nanotubi hanno mostrato un
accumulo cellulare specifico nei nucleoli delle varie cellule tumorali, pur non
perturbano la loro morfologia. È interessante notare inoltre che la localizzazione
nucleolare di queste particelle è reversibile, e la ridistribuzione nel nucleoplasma e nel
citoplasma ha avuto luogo quando le nanoparticelle sono state rimosse dal supporto di
coltura cellulare. Analogamente, le microsfere NP coniugate al peptide Tat, una
porzione della proteina Tat del HIV-1, si accumulano in maniera significativa nei
nucleoli delle cellule HeLa permeabilizzate. I nanocomposti costituiti da nanoparticelle
di TiO2 e oligonucleotidi contenenti sequenze corrispondenti a rDNA si sono localizzati
nel nucleolo con un assorbimento simile ai soli oligonucleotidi. In contrasto con gli
esempi precedenti, le NP SiO2 fluorescenti non sono state localizzate nel nucleolo;
tuttavia, sono state influenzate da una redistribuzione temporale della proteina
nucleolare Topo I.
10. Peptidi come bersaglio nucleolare
I peptidi come bersaglio nucleolare sono una famiglia di peptidi cellula-penetranti
(CPP) che sono in grado di colpire e localizzare i nucleoli delle cellule. Una tale
sequenza peptidica, NrTP1 (YKQCHKKGGKKGSG), è stata etichettata mediante la
63
pancreatico (BxPC-3), il carcinoma duttale della ghiandola mammaria, (BT-474) e le
cellule del neuroblastoma murino (N2A). In tutti i casi, eccetto per le cellule N2A, è
stato dimostrato che, mediante la microscopia confocale, NrTP1 si accumula nei
nucleoli delle cellule, indipendentemente dalla fase del ciclo cellulare. È stato osservato
inoltre che il polipeptide è stato assorbito dalle cellule in dipendenza dalla dose di
clatrina-mediata per endocitosi. E’ stato dimostrato mediante microscopia confocale un
altro CPP marcato dalla fluoresceina b3-octaarginina che si localizza nei nucleoli degli
eritrociti infettati da Plasmodium falciparum; tuttavia, non è stato in grado di penetrare
negli eritrociti sani e intatti. Queste proprietà potrebbero portare allo sviluppo di nuovi
composti farmaceutici di CPP che trasportano selettivamente il farmaco verso le cellule
infette (o maligne).
4.6 Discussione
Il ruolo del nucleolo nel sostenere la crescita delle cellule offre un'opportunità
interessante per l'intervento chemioterapico. E’ stato identificata una gamma diversificata di molecole che colpiscono questa struttura sub-nucleare, direttamente o
che influenzano le sue funzioni in qualche modo indiretto. Questi includono intercalanti
del DNA, leganti del solco minore, metallanti e alchilanti elettrofili, così come gli
agenti ibridi che combinano molteplici modalità vincolanti. Tuttavia, la gamma di
molecole nucleolo-mirata non è limitata agli agenti interagenti con il DNA.
Antimetaboliti, inibitori della chinasi, farmaci anti-infiammatori, antibiotici prodotti
naturali, oligopeptidi, nonché particelle nanometriche, mostrano anche proprietà
specifiche in relazione al nucleolo. Tra gli agenti diretti sull'acido nucleico, i composti
che inibiscono selettivamente la trascrizione dei geni rRNA (rDNA), sono
64
ripetizioni in tandem di rDNA (45S gene) sono ricche di G e quindi sono un target
"naturale" ad alta affinità con molti agenti elettrofili (platini, mitomicina, ecc.). Una
sfida importante nella progettazione di leganti al DNA diretti al nucleolo è quella di
dotare queste molecole di alcune proprietà che permettessero una selettività maggiore in
relazione a questa struttura risparmiando le sequenze di contenuti base simili all'interno
della cromatina circostante. Un approccio particolarmente promettente in questo senso è
quello di progettare molecole che riconoscano e si leghino a strutture di acido nucleico
non-duplex (CX-3543, CX-5461, naftalene diimide), come le sequenze G-quadruplex,
abbondanti nelle copie del gene 45S. Oltre alla progettazione di tali farmacofori,
potrebbe esserci l'occasione di riproporre agenti citotossici clinici e sperimentali
esistenti come le terapie nucleolo-dirette su base vettoriale(peptidi, nanoparticelle).
Questi includono elettrofili chimicamente promiscui e DNA leganti aspecifici che
mostrano entrambi effetti collaterali sfavorevoli o che sono stati esclusi interamente
essendo eccessivamente tossici per un uso clinico. Infine, un altro caso rilevante
potrebbe essere fornito dal targeting del nucleolo tramite agenti che producono addotti
permanenti nel DNA. A differenza degli addotti del DNA genomico trascritti dalla RNA
polimerasi II, il danno nucleolare del rDNA non è efficacemente rimosso dalla
riparazione per escissione di nucleotidi (NER). NER è una forma importante di
riparazione (di addotti di DNA e legami interni clinicamente rilevante e farmaco-
indotta) ed è un mediatore e un biomarcatore di resistenza tumorale. In conclusione, la
diversa natura delle molecole che agiscono sul nucleolo della cellula offre una potente
piattaforma per la progettazione di terapie che superano molti degli inconvenienti
65
CONCLUSIONI
Tradizionalmente il contributo del nucleolo nella tumorigenesi era in gran parte
centrato sul suo ruolo che giocava nel facilitare la biogenesi dei ribosomi e la capacità
proliferativa, studi più contemporanei dimostrano che il nucleolo probabilmente gioca
un ruolo molto più ampio nella trasformazione maligna. In particolare, le funzioni
supplementari ribosomali del nucleolo come integratore centrale di stress cellulare
stanno emergendo come nuovi meccanismi con cui oncogeni e soppressori tumorali
possono modulare le proprie funzioni in cellule normali e maligne. L'elevata dipendenza
di alcune cellule tumorali dai processi nucleolari per mantenere il loro fenotipo
tumorale è stato chiaramente dimostrato mediante l'applicazione di piccoli inibitori della
molecola di Pol I selettivamente ad alcune cellule tumorali in vivo.
Un aspetto importante per quanto riguarda la struttura e la funzione del nucleolo sono
le differenze morfologiche presenti tra cellule somatiche normali e cellule neoplastiche.
È stato ben stabilito che un aumento della trascrizione del rRNA, come ha luogo nella
replicazione accelerata delle cellule, comporta un aumento considerevole delle
dimensioni del nucleolo. Questo rapporto è ancora più evidente se il gene soppressore
tumorale p53 è mutato o assente, ciò comporta la formazione di grandi nucleoli
ipertrofici. In particolare, le mutazioni di p53 sono presenti in più del 50% di tutti i
tumori umani. I nucleoli ingrossati supportano una rapida crescita delle cellule
tumorali. Poiché i nucleoli persistono in tutte le fasi di crescita del ciclo cellulare, la
down-modulation della sintesi del rRNA può essere considerata un modo diretto di
inibire il potenziale proliferativo di cellule tumorali. L’interruzione della trascrizione e dell’elaborazione di rRNA, così come altre forme di stress nucleolare, può portare ad un
66
arresto del ciclo cellulare e alla morte cellulare programmata in fase G1 o G2. Questo
include percorsi p53-mediati in cellule con p53 funzionale. Un altro percorso
importante che coinvolge la proteina retinoblastoma (pRb) sembra influenzare la
trascrizione dell'RNA e l'ipertrofia nucleolare. I tumori con p53 e pRb inattivi sono
caratterizzati da una maggiore aggressività e una prognosi più negativa. Inoltre, i
percorsi Myc e PI3K-AKT-mTOR hanno mostrato un meccanismo di cooperazione per
la promozione della biogenesi del ribosoma. Di conseguenza, quando questi percorsi
sono iperattivi, sono più propensi a portare a forme più aggressive e resistenti di cancro.
Dall’evidente cambiamento nelle dimensioni del nucleolo osservato nella carcinogenesi, i farmaci che mirano al nucleolo hanno la capacità di produrre un impatto immediato e
dannoso sulle cellule tumorali, pur risparmiando un numero maggiore di cellule
normali. Infatti è probabile che si sia solo cominciato a graffiare la superficie del
potenziale del nucleolo come un nuovo target per la terapia del cancro.
Prospettive future.
Idealmente, i regimi di trattamento del cancro dovrebbero essere basati sull’integrità dei percorsi cellulari, e i nucleoli forniscono un’importante apertura alla risposta delle cellule allo stress. Ad esempio il nucleolo subisce modifiche specifiche nella
composizione e nella struttura in risposta agli agenti chemioterapici che danneggiano il
DNA cellulare, incluso il rilascio di proteine che regola il soppressore tumorale p53.
Dunque, una risposta atipica del nucleolo alla chemioterapia può essere utilizzata per
identificare dei problemi nel percorso di p53 nel caso in cui non siano stati identificati
67
per alcuni cambiamenti funzionali nel percorso molecolare associato alla soppressione
tumorale. Inoltre i cambiamenti della funzione tumorale possono essere utilizzati per
monitorare la risposta al trattamento e, se utilizzati nelle biopsie e nelle analisi ex-vivo,
come criterio di selezione del più efficace trattamento cancerogeno per ciascun paziente.
Per concludere, il numero dei nucleoli, la loro morfologia e la loro composizione
biochimica influenza l’intera salute cellulare e l’integrità dei percorsi coinvolti nel processo di progressione delle cellule, nella risposta delle cellule allo stress, nel
mantenimento dell’integrità genetica e nella soppressione tumorale.
L’utilità dei nucleoli nelle patologie cancerose non è più ristretta al contesto AgNOR e alle dimensioni nucleolari. Oggigiorno troviamo infatti un insieme (in rapida
espansione) di proteine nucleolari associate che agiscono da biomarcatori per la
diagnosi e la prognosi del cancro, oltre che per la scelta del tipo di trattamento e di
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