Amplificazione dei riarrangiamenti genetici dei recettori antigene-specifici tramite PCR

Precedentemente è stato descritto il complesso meccanismo di riarrangiamento genico del TCR e delle immunoglobuline, in cui la scelta dei segmenti genici da ricombinare avviene in maniera relativamente casuale, in modo tale che ogni singola cellula B o T sia caratterizzata da un unico pattern di

riarrangiamenti recettoriali (Vernau, 2004). In una neoplasia linfoide, al contrario, ogni clone di cellule neoplastiche B o T presenta un unico ed identico riarrangiamento genico delle Ig o del TCR, che può essere utilizzato come marker molecolare specifico di clonalità (Rezuke et al, 1997; Medeiros e Carr, 1999).

A questo scopo, la PCR viene applicata nell’identificazione di riarrangiamenti genici clonali in quei segmenti di DNA che codificano per le regioni variabili dei geni delle Ig e del TCR, amplificando le V(D)J splice junctions di entrambi i tipi di recettore.

L’eterogeneit{ dell’aggiunta (e della delezione) dei nucleotidi N nei punti di giunzione tra i segmenti genici V, D e J, determina un fingerprint esclusivo per ogni dato riarrangiamento che offre un bersaglio sensibile e specifico per l’amplificazione mediante PCR (Rezuke et al, 1997; Vernau e Moore, 1999; Cazzaniga e Biondi, 2005).

Il riarrangiamento clonale dei segmenti VDJ della catena pesante delle Ig è tipico delle neoplasie linfoidi a cellule B e può essere amplificato mediante PCR utilizzando primer che legano il segmento genico V ed il segmento genico J della regione variabile delle catene pesanti delle Ig.

La Figura 2.3.2.I mostra come si realizza, mediante PCR l’amplificazione genica dei riarrangiamenti immunoglobulinici. Primer V Primer V Primer J Primer J Linea Germinale Riarrangiamento VDJ Nessun prodotto PCR Prodotto PCR

Prodotto PCR monoclonale su gel di Agarosio (C) Primer V Primer V Primer J Primer J Linea Germinale Riarrangiamento VDJ Nessun prodotto PCR Prodotto PCR

Prodotto PCR monoclonale su gel di Agarosio (C)

Figura 2.3.2.I: Illustrazione schematica del funzionamento della PCR nell’identificazione di un riarrangiamento genico B. Da Rezuke et al; 1997, modificato.

Primer V Primer V

Per amplificare con successo un segmento di DNA, i primer utilizzati devono riconoscere sequenze geniche poste all’interno di una corta sequenza di DNA. Nello schema genico della linea germinale, le sequenze target dei primer all’interno dei segmenti genici V e J sono ampiamente separate per l’assenza dei riarrangiamenti genici, perciò non è possibile ottenere alcun prodotto amplificato (Figura 2.3.2.I, linea A); soltanto in caso di riarrangiamento VDJ, la vicinanza dei segmenti genici permette l’amplificazione di un prodotto.

In una popolazione policlonale, ciascuna cellula presenta una diversa specificità antigenica ed un distinto riarrangiamento genico, pertanto, il prodotto amplificato, visualizzato mediante elettroforesi, è rappresentato da bande (frammenti) di diversa lunghezza risultanti in uno smear pattern (Figura 2.3.2.I, linea B).

In una popolazione monoclonale al contrario, tutte le cellule presentano identici riarrangiamenti, per cui il prodotto amplificato è rappresentato da una singola banda discreta (Figura 2.3.2.I, linea C) (Rezuke et al, 1997).

Come già detto in precedenza, nei linfociti B, la regione variabile della catena pesante (VH) è costituita da 3 regioni framework (FR), in cui sono presenti sequenze nucleotidiche conservate e da 3 regioni CDR, in cui sono presenti sequenze ipervariabili di DNA che codificano per la regione legante l’antigene e che sono sottoposte al processo di ipermutazione somatica. CDRI, CDRII e tutte le regioni FR sono codificate dal segmento genico V, mentre la CDRIII viene codificata dal segmento genico D e dai segmenti di DNA posti tra le giunzioni V-D e D-J (Figura 2.3.2.II).

Figura 2.3.2.II: Organizzazione genetica della regione variabile delle Immunoglobuline. Da Rezuke et al, 1997.

I metodi comunemente impiegati in Medicina Umana riguardano l’amplificazione della regione CDRIII della catena pesante delle Ig, utilizzando come sonde degli oligonucleotidi che presentano omologia

con le sequenze conservate della regione FRIII dei segmenti genici VH e con quelle dei segmenti genici JH (Ramasamy et al, 1992).

La costruzione di primer, disegnati in accordo alla sequenza della CDRIII del clone neoplastico d’esordio, rende più sensibile la rilevazione delle cellule neoplastiche e può essere utilizzato per lo studio della MRM.

Nella valutazione delle neoplasie B-cellulari, l’utilizzo di questi primer permette di identificare la clonalità nel 50-60% dei casi; in una buona percentuale di pazienti, in effetti, l’amplificazione di VDJ può non riuscire, a causa di mutazioni che non permettono un corretto annealing, o perché, essendo la costruzione di questi primer basata su un limitato numero di sequenze IgH, non è possibile legare tutti i possibili segmenti VH (Rezuke et al, 1997).

Per aumentare la sensibilità di tale tecnica, è possibile amplificare un segmento di DNA più grande, utilizzando dei primer complementari alla regione FRI, posta più esternamente rispetto alla FRIII (Figura 2.3.2.II); quest’ultima presenta una sequenza sufficientemente conservata da rendere possibile l’utilizzo di un solo primer, diversamente dalla regione FRI che richiede, per la sua eterogeneità, l’utilizzo di sette differenti primer, che corrispondono alle 7 famiglie di geni VH, identificate in medicina umana (Ramasamy et al, 1992).

Nonostante la maggior complessità di esecuzione, utilizzando la regione FRI, è possibile individuare riarrangiamenti genici delle immunoglobuline nel 94% delle neoplasie linfoidi a cellule B e quindi di ridurre, rispetto al primo metodo, il numero di falsi negativi (Ramasamy et al, 1992).

Per quanto riguarda le neoplasie a cellule T, poiché i geni del TCRα sono molto complessi e i geni del TCRδ sono spesso deleti nelle cellule T mature, il TCRγ e il TCR β rappresentano i più efficienti target per l’amplificazione mediante PCR (Rezuke et al, 1997).

In medicina umana, lo studio sulla clonalità delle neoplasie linfoproliferative a cellule T, viene eseguita mediante l’analisi del locus γ (TCR γ) che fornisce un rendimento diagnostico migliore di quella del locus β (TCR β); questo vantaggio è dato dal fatto che il locus γ viene sottoposto a riarrangiamenti genici con maggiore frequenza nelle cellule T, indipendentemente dall’espressione del TCR di superficie. Inoltre, il numero limitato dei segmenti genici V e la mancanza dei segmenti genici D,

rendono il locus γ, più semplice da studiare per selezionare i primer ed ottimizzare la PCR (Theodorou et al, 1996; Rezuke et al, 1997).

I riarrangiamenti del locus γ risultano più semplici da rilevare rispetto a quelli del TCRβ e rappresenterebbero pertanto una misura più sensibile di clonalità rispetto ai riarrangiamenti del TCRβ (Burnett et al, 2003).