MATERIALI E METOD
2. ANALISI DELL’ACCURATEZZA DEL METODO IN PROVA XN-BF MEDIANTE COMPARAZIONE CON IL METODO IN USO LEUCOCOUNT
Il numero di leucociti residui/µl è stato conteggiato sulla stessa unità di campionamento prelevata da ciascun emocomponente leucodepleto con il metodo di riferimento Leucocount e con il metodo in prova XN-BF.
In figura 3 sono riportati i risultati dei due metodi di conteggio suddivisi per le tre tipologie di emocomponenti in studio: concentrati eritrocitari da aferesi, concentrati piastrinici da aferesi e concentrati piastrinici da pool di BC. In generale i conteggi mediante metodo in prova sono più elevati di quelli del metodo in uso. Il numero dei leucociti ottenuti in modalità XN-BF è più elevato rispetto al Leucocount su tutti i concentrati piastrinici da pool di BC e risulta essere da 1,4 a 356 volte maggiore. Su 11/15 concentrati piastrinici da aferesi è tra 1,12 e 40 volte maggiore rispetto al Leuccount mentre è comparabile per i restanti 4/15. Su 17/20 concentrati eritrocitari è incrementato da 1,35 a 38 volte rispetto al Leucocount e comparabile per 3/20. La dispersione dei conteggi ottenuti dalle due modalità di conteggio, rappresentata da valore mediano e range, è riportata in tabella 2.
a b
Figura 3. Numero di leucociti residui in 20 concentrati eritrocitari da aferesi (ER aferesi), 15 concentrati piastrinici da aferesi (PTL aferesi) e in 54 concentrati piastrinici da pool di BC (pool) conteggiati con Leucoount (a) e XN-BF (b). Il numero di leucociti residui è espresso per µl. La barra orizzontale indica il valore mediano dei leucociti residui/µl.
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Tabella 2. Valore mediano e range dei conteggi in Leucocount e XN-BF sulle unità leucodeplete
Le coppie di valori ottenuti dai due conteggi, espresse in leucociti/µl sono state confrontate mediante l’analisi di regressione di Passing e Bablok (63). I dati di regressione mostrano la presenza di un errore sistematico proporzionale (indicato dalla pendenza della retta di regressione) tra i due metodi. Infatti la pendenza è >1 e 1 non è compreso nell’intervallo di confidenza (IC) 95% (figura 4).
Figura 4. Confronto dei conteggi dei leucociti residui con Leucocount e Sysmex XN-9000 in modalità fluido biologico (BF) in una serie di 89 emocomponenti. Il numero dei leucociti residui/µl ottenuti con il metodo Leucocount (asse x) è riportato verso il numero ottenuto per lo stesso campione con il metodo in prova XN-BF (asse y). In blu è disegnata la linea di regressione, le linee tratteggiate spesse delineano gli intervalli di confidenza (IC) e la linea tratteggiata fine la retta di identità (x=y). In tabella sono riportate la pendenza e l’intercetta della retta di regressione con i relativi intervalli di confidenza (IC).
Emocomponente N° LEUCOUNT (leucociti/µl) XN-BF (leucociti/µl)
Valore mediano Range Valore mediano Range
Tutte le unità 89 0,11 0,0-12,3 2,0 0,0-26,0
Concentrato piastrinico da pool di BC 54 0,19 0,0-12,3 7,0 1,0-26,0
Concentrato piastrinico da aferesi 15 0,11 0,0-2,8 2,0 0,0-5,0
Concentrato eritrocitario da aferesi 20 0,10 0,0-0,7 1,0 0,0-3,0
Emocomponente N° (coppie di valori) Pendenza (95% IC) Intercetta (95% IC)
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L’entità dell’errore è stata accertata mediante grafico di Bland-Altman e calcolo del bias (63). I risultati sono riportai in figura 5. La media delle differenze tra i due metodi su tutti i campioni (bias) è 5 leucociti/µl. Il bias risulta significativo, dato che l’intervallo di confidenza al 95% del bias (delimitato dalle due linee tratteggiate in verdi) non comprende lo zero, ma è ampiamente al di sopra. Il 95% delle differenze dei due metodi è compreso nell’intervallo 17 e -7. Questo intervallo permette di identificare l’entità della maggior parte (95%) delle differenze riscontrate. È possibile osservare la presenza di una dipendenza tra il numero dei leucociti residui conteggiati (x) e le differenze (y). Ai più alti conteggi corrisponde una differenza da parte del metodo in prova maggiore.
Gli emocomponenti presentano differenze riguardo modalità di produzione, componente e numerosità della componente cellulare e per la sostanza nutritiva conservante. Abbiamo voluto comparare le coppie di valori ottenuti da ciascuna tipologia di emocomponente. L’analisi del bias mediante grafico di Bland-Altman conferma il risultato ottenuto all’analisi combinata: la presenza di un bias significativo (figura 5 b, c, d) per tutte le tipologie.
Sui conteggi dei concentrati piastrinici da pool di BC si osservano differenze maggiori del metodo in prova rispetto a quello in uso (bias medio = 7,3). Il 95% delle differenze è compreso nell’intervallo tra 20,7 e -6,1. Sui conteggi sulle unità da aferesi il bias medio che si ottiene è inferiore: 1,5 per i concentrati piastrinici, 1,22 per quelli eritrocitari. Il 95% delle differenze sono comprese in un intervallo di 4,5 e -1,4 per i concentrati piastrinici da aferesi e tra 3,03 e -0,59 per i concentrati eritrocitari.
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Figura 5. Valutazione del bias mediante il confronto tra metodi secondo Bland e Altman. Nel grafico, la media dei conteggi ottenuti per ciascun campione da entrambi i metodi (media dei due metodi) è riportata sull’asse ascisse, e le differenze tra i due conteggi sull’asse y (metodo in prova (XN-BF) metodo in uso Leucocount). È rappresentata la differenza media o bias (mean) ed il relativo intervallo di confidenza (linee tratteggiate in verde), e l’intervallo che comprende il 95% di tali differenze, calcolato utilizzando media ± 1,96xDS, dove la media e DS sono rispettivamente il bias e la deviazione standard delle differenze trovate (linee tratteggiate rosse). I risultati sono riportati per tutte le unità (a) e separatamente sui concentrati piastrinici da pool di BC (b), sui concentrati piastrinici da aferesi (c) e sui concentrati eritrocitari (d).
a b
c d
Emocomponente N Bias IC (95%) DS delle differenze Intervallo delle differenze (IC 95%)
Tutte le unità 89 5 (4; 6) 8,6 (-7; 17)
Concentrato piastrinico da pool di BC 54 7,3 (5; 9) 7,3 (-6,1; 20,7) Concentrato piastrinico da aferesi 15 1,5 (2,4; 0,7) 1,5 (-1,4; 4,5) Concentrato eritrocitario da aferesi 20 1,22 (1,7-0,8) 1,22 (-0,59; 3,03)
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3.EFFETTO DELLA MATRICE DEI CONCENTRATI PIASTRINICI SULLE QUALITÀ ANALITICHE DELL’XN-BF
Partendo da un campione a concentrazione nota di globuli bianchi, sono state allestite quattro diluizioni utilizzando tre differenti tipi di matrice: diluente Cell Pack DCL, soluzione nutritiva Composol PS, pool da BC (vedi paragrafo 4.2 Materiali e Metodi).
I risultati dei conteggi sono riportati in tabella 3. Il coefficiente di variazione si mantiene buono (< 20%) fino a conteggi intorno a 20-40 leucociti/µl (diluizioni 1:100) in tutte le matrici. Per conteggi intorno a 4-2 leucociti/µl (diluizione 1:1000) si eleva fino a 30% circa per le diluizioni in matrice Composol PS e in pool di BC.
Come atteso il coefficiente di variazione per tutti i conteggi con la metodica Leucocount si mantiene < 10% e in particolare per i campioni contenenti circa 3 leucociti/µl (diluizione 1:1000).
La linearità risulta eccellente (R2 = 1,00) in tutte e 3 le matrici (tabella 4) sia con metodica XN-BF che Leucocount.
Tabella 3. Precisione dei conteggi in modalità fluido biologico (BF) nelle varie matrici. DS, deviazione standard; CV, coefficiente di variazione.
Cell Pack DCL Composol PS Pool da BC Pool da BC
Leucociti/µl (BF) Leucociti /µl (BF) Leucociti /µl (BF) Leucociti /µl (Leucount) media DS CV (%) media DS CV (%) media DS. CV (%) media DS CV (%)
1:2 3153 51 1,6 3067 15 0,5 3207 11 0,3 2707 84 3,1
1:10 296 12 4,0 304 10 3,1 322 14 4,4 256 23 8,9
1:100 28 2 5,4 20 1 2,8 43 7 15,4 27 3 11,3
1:1000 4 1 15,7 2 1 34,6 7 2 28 3 0 8,7
matrice 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabella 4. Valutazione della linearità dei conteggi in XN-BF nelle 3 matrici e con Leucocount nel pool da BC.
Matrice (modalità di conteggio) Pendenza Intercetta R2
Cell Pack DCL (BF) 1,00 -5,15 1,00
Composol PS (BF) 0,98 -3,61 1,00
Pool da BC (BF) 1,02 4,28 1,00
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Figura 6.Confronto tra i conteggi eseguiti su campioni diluiti nelle varie matrici. Sull’asse delle X è riportato il valore atteso, sull’asse delle Y il valore medio del conteggio con XN-BF e Leucocount.
Il grafico in figura 6 mostra il valore medio dei conteggi ottenuti sui campioni diluiti nelle varie matrici, nel’intervallo di interesse tra 3 e 30 leucociti. I valori ottenuti sulle diluizioni in pool di BC eseguiti con l’XN-BF sono più elevati rispetto alle diluizioni corrispondenti in Cell pack DCL e in Composol PS. Diversamente i valori ottenuti con metodica Leucocount sulle diluizioni da pool di BC sono invece comparabili con le stesse ottenute nella matrice Cell Pack DCL e Composol PS, ma conteggiate con metodo XN-BF.
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 le uc o ci ti c o nt eg gi at i ( /µ l) leucociti attesi (/µl)
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4.VALUTAZIONE DELL’ACCETTABILITA’ DEL NUOVO METODO
Abbiamo voluto valutare se il metodo in prova pur non allineato con quello in uso fosse accettabile nel classificare gli emocomponenti in prodotti conformi oppure non conformi. Un’unità di emocomponente leucodepleto risulta conforme agli standard normativi se contiene < 1 x 106 leucociti.
Il CQI della contaminazione da leucociti delle unità dopo leucodeplezione prevede di calcolare la quantità di leucociti residui totale in ogni unità moltiplicando il numero dei leucociti/µl determinati con il Leucocount per il volume (ml) del rispettivo emocomponente ed esprimerlo x 106. In tabella 6a sono riportati i risultati del CQI. La contaminazione da leucociti residui è <1 x106 in tutte le unità di piastrine e di emazie da aferesi e in 48/54 (89%) concentrati piastrinici da pool di BC. In 6/54 (11%) unità piastriniche da pool di BC è >1 x 106.
In tabella 6b è riportato il numero delle unità conformi e non conformi risultate dai conteggi con il metodo in prova (XN-BF). Tutte le unità di emazie concentrate sono conformi anche per il metodo in prova, mentre il numero dei concentrati piastrinici conformi scende a 25/54 (46%) per i pool di BC e a 13/15 (87%) per quelli da aferesi. L’incremento delle non conformità interessa i soli concentrati piastrinici: 29/54 (54%) unità da pool di BC e 2/15 (13%) da aferesi.
In confronto al metodo di riferimento Leucocount, il metodo in prova riesce a classificare correttamente 20/20 (100%) unità di emazie da aferesi, 13/15 (87%) unità di piastrine da aferesi e 31/54 (57%) unità di piastrine da pool di BC. Delle 31 /54 unità da pool di BC 25 erano conformi e 6 non conformi. D’altra parte attribuisce erroneamente solo false non conformità (FN) a 25/69 (36%) concentrati piastrinici (23/54 pool di BC e 2/15 da aferesi). Il metodo in prova non classifica nessuna unità falsamente conforme (FP).
In tabella 7 e figura 7 è riassunta la valutazione dell’accettabilità del metodo in prova. Il metodo XN-BF mostra una sensibilità del 100% per l’identificazione dei concentrati eritrocitari. Attribuisce invece ad un elevato numero di concentrati piastrinici la non conformità (25/69) mostrando una sensibilità del 60%. Non identificando invece false conformità (FP=0), la probabilità che una unità risulti conforme mentre non lo è (specificità del metodo) diventerebbe nulla (tabella 7, figura 7).
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Tabella 6. In a sono riportati i risultati del controllo di qualità sugli emocomponenti in studio (Leucocount). E’riportato il numero totale (N) analizzato per ciascuna emocomponente, il numero con relativa percentuale (%) delle unità conformi (< 1X106 leucociti) e delle non conformi (> 1X106).
In tabella b sono riportati i risultati ottenuti dai conteggi in modalità XN-BF per le stesse unità.
a EMOCOMPONTE N < 1X106 leucociti (Leucocount) % > 1X106 (Leucocount) %
Concentrati piastrinici da pool di BC 54 48 89 6 11
Concentrati piastrinici da aferesi 15 15 100 0 0
Concentrati eritrocitari da aferesi 20 20 100 0 0
b EMOCOMPONTE N < 1X106 leucociti (XN-BF) % > 1X106 (XN-BF) %
Concentrati piastrinici da pool di BC 54 25 46 29 54
Concentrati piastrinici da aferesi 15 13 87 2 13
Concentrati eritrocitari da aferesi 20 20 100 0 0
Figura 7. Sono rappresentate le unità piastriniche classificate dal modo BF come vere conformi (VP), false conformi (FP), vere non conformi (VN), false non conformi (FN). Per ciascun gruppo è indicato il numero di unità.
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Tabella 7. Valutazione dell’accettabilità del Sysmex XN-9000 in modalità fluido biologico (XN-BF) per il controllo della conformità delle unità leucodeplete.
Sysmex XN-9000 modalità fluido biologico (XN-BF)
Concentrati eritrocitari Concentrati piastrinici Vere conformi (VP)
(<1X106)
20 38
False non conformi (FN) 0 25
Vere non conformi (VN) (>1X106)
0 6
False conformi (FP) 0 0
Sensibilità (VP/(VP+FN) 100% 60%
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CAPITOLO 5
DISCUSSIONE
Le linee guida europee e la normativa vigente a livello nazionale (3, 4) indicano che un numero di leucociti residui < 1 x 106 per unità sottoposta a leucodeplezione (<3,3 leucociti/µl per una unità di volume medio di 300 ml) possa essere sufficiente a prevenire nei riceventi reazioni trasfusionali associate alla presenza di leucociti contaminanti. Il metodo manuale in camera di conta di Nageotte e i metodi citofluorimetrici hanno dimostrato di avere una sensibilità tale da poter conteggiare in maniera accurata il numero
sempre più basso di leucociti residui negli emocomponenti (104-105/unità). I metodi
citofluorimetrici per la migliore standardizzazione e velocità di esecuzione, sono stati preferiti all'esame manuale in microscopia, che comunque continua a costituire il gold standard per i conteggi dei leucociti negli emocomponenti, così come nei fluidi biologici (61). Presso la S.C. Immunoematologia e Medicina Trasfusionale dell'Estar Nord-Ovest presidio di Lucca il CQI del processo di leucodeplezione è eseguito in citofluorimetria, conteggiando il numero assoluto di leucociti mediante kit diagnostico certificato, Leucocount, secondo le indicazioni del produttore.
Tecniche più semplici e a basso costo, come quelle automatizzate di emocitometria, potrebbero essere prese in considerazione, soprattutto in situazioni di numerosità di campioni e di ridotte risorse economiche.
Da pochi anni gli analizzatori automatizzati di ematologia sono stati implementati per conteggiare le cellule in liquidi biologici di varia origine (liquido cefalorachidiano, pleurico, ascitico, sinoviale, pericardico e peritoneale) in modo rapido ed economico (62).
Il nuovo analizzatore di ematologia Sysmex XN-9000 è dotato di un modulo dedicato ai conteggi cellulari sui fluidi biologici (XN-BF). I Sysmex della serie XN hanno dimostrato di essere accurati e sensibili per processare varie tipologie di liquidi biologici, dal liquido cefalorachidiano ai liquidi cavitari e sierosi (57, 58, 59).
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Il conteggio su XN-BF è stato anche proposto come metodo alternativo a quelli manuali in microscopia per monitorare il basso numero di leucociti (tra 0 e 5 leucociti/µl)
dopo il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (56).
In questo studio abbiamo voluto valutare l’XN-9000 BF come potenziale nuovo metodo, alternativo al Leucocount in uso di routine, per il controllo della contaminazione leucocitaria nelle unità leucodeplete.
In via preliminare abbiamo valutato la qualità analitica dell’XN-9000 BF. Il limite di sensibilità degli analizzatori della serie XN in modalità BF descritto in letteratura è 1 cellula/µl (56). Utilizzando il controllo di qualità interno per fluidi biologici XN BF-check la linearità dei conteggi è assicurata tra 0 e 12.000 leucociti, e il limite di quantificazione (LoQ) con un coefficiente di variazione del 20% è 5 cellule/µl (60). L'XN-9000 BF in particolare sarebbe in grado di raggiungere performances migliori, con un coefficiente di variazione del 22,94% in campioni contenenti 5 cellule/µl o meno, e un LoQ di 3 cellule/µl (coefficiente di variazione <20%) (64). I nostri dati concordano con quest'ultima osservazione: i conteggi di 2,3 cellule/µl hanno un coefficiente di variazione del 21,3%, del 31% intorno a 1,7 leucociti/µl.
La linearità si mantiene ottima nei conteggi tra 1,7 e 10 cellule/µl (R2=0,99).
Nelle nostre condizioni sperimentali l'XN-9000 BF potrebbe dare quindi conteggi affidabili per unità contenenti almeno 2 leucociti/µl. Le raccomandazioni hanno stabilito per il plasma fresco un limite di 100 leucociti/µl, mentre per i concentrati piastrinici ed eritrocitari di 3,3 leucociti/µl. I nostri dati dimostrano che il metodo potrebbe essere ottimo per il conteggio dei leucociti su campioni di plasma e sufficientemente adeguato sia sui concentrati piastrinici, che costituiscono la maggior parte dei campioni sottoposti al CQI presso la S.C. Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, che su quelli eritrocitari. Naturalmente, a seconda del contenuto iniziale di leucociti per unità e dell’efficienza della leucodeplezione, è atteso che molti di questi campioni contengano quantità nettamente inferiori a 3,3 leucociti/µl. Il conteggio in XN-BF non sarebbe in grado di distinguere campioni contenenti <1 leucocita/µl dal rumore di fondo (0 strumentale)
Le finalità del CQI nel monitorare la leucodeplezione negli emocomponenti è stabilire se l’unità presenta una contaminazione leucocitaria superiore o inferiore alla soglia
raccomandata (1x106). L'accuratezza del conteggio potrebbe essere anche un requisito non
necessario. Abbiamo stabilito di valutare l'accettabilità del nuovo metodo sulla base delle capacità di classificare le unità in contaminate (> 1x106 leucociti) o non contaminate (<
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In base a questi presupposti abbiamo direttamente confrontato i risultati dei conteggi nei concentrati piastrinici ed eritrocitari ottenuti con l'XN-9000 BF con quelli ottenuti con il Leucocount.
L'analisi di regressione di Passing e Bablok di 89 emocomponenti totali indica un errore sistematico proporzionale dei conteggi in modalità BF rispetto al Leucocount. L’analisi del bias, con il metodo di Bland Altman, mostra che i conteggi in XN-BF appaiono sovrastimare in modo significativo il conteggio Leucocount nella maggior parte delle unità. L’analisi separata sulle tre tipologie di emocomponenti evidenzia un errore elevato (bias significativo) con un errore medio di 7 leucociti/µl ed un intervallo delle differenze molto ampio sui concentrati piastrinici da pool di BC. I conteggi sui prodotti di aferesi, pur presentando anch’essi un bias significativo, mostrano un errore più piccolo, differendo in media di solo 1,5 leucocita/µl le piastrine e 1,22 leucociti/µl le emazie, con intervalli delle differenze in queste ultime al di sotto del limite di contaminazione leucocitaria del prodotto.
In letteratura non ci sono dati riguardo l’impiego dell’XN-9000 BF sugli emocomponenti, ma i nostri risultati accorderebbero con dati preliminari effettuati da un altro gruppo italiano sui concentrati piastrinici (comunicazione privata).
La comparazione tra metodi indicherebbe quindi la presenza di una differente specificità dell’XN-BF sul conteggio dei leucociti in particolare sui concentrati piastrinici.
I leucociti residui sono misurati in una matrice complessa, costituita da una soluzione elettrolitica nutritiva, e da elevate quantità di piastrine.
Quando abbiamo confrontato i conteggi su campioni ottenuti diluendo quantità note di leucociti in una matrice costituita dalla sola sostanza nutritiva o dalla sostanza nutritiva in cui era stato risospeso un pool di piastrine leucodepleto si osserva su quest’ultimo una sovrastima per tutti i valori. Questo effetto matrice non si osserva quando le stesse diluizioni nel pool sono conteggiate con Leucocount. La matrice sembrerebbe comunque non influenzare la linearità e precisione dei conteggi.
L’interferenza positiva sul conteggio sembrerebbe quindi attribuibile più che alla composizione elettrolitica della sostanza nutritiva, alle caratteristiche della componente biologica nel concentrato. L'aggregazione piastrinica, insieme alla presenza di piastrine giganti, è una delle interferenze positive dichiarate dalla ditta produttrice sui conteggi nel canale dei leucociti (65). È plausibile pensare che fenomeni di attivazione ed aggregazione piastrinica, intercorse durante conservazione dell’unità, possano aver generato eventi fluorescenti aspecifici conteggiati dall’analizzatore nel cluster dei leucociti. Anche le fasi di
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produzione del pool potrebbero avere indotto questi eventi, dato che sembrerebbero interessare maggiormente i pool piuttosto che i concentrati da aferesi.
Non possiamo escludere comunque un seppur debole effetto matrice anche per i conteggi sui concentrati eritrocitari, dato che sono rispospesi in una sospensione praticamente priva di plasma e ricca di molecole organiche (SAGM).
Nonostante i conteggi del metodo in prova non siano accurati su queste tipologie di campioni, gli scostamenti dal metodo considerato di riferimento, sebbene elevati e significativi a questi bassi valori di concentrazioni, potrebbero non avere effetto riguardo la classificazione delle unità.
Il metodo XN-BF sembrerebbe infatti presentare una ottima attitudine ad identificare le unità conformi per i concentrati eritrocitari (sensibilità 100%), risulta invece mediocre nell’identificare i concentrati piastrinici (sensibilità 60%). In questo contesto è importante notare che il metodo BF non identificherebbe false conformità e potrebbe quindi essere impiegato in una fase di screening.
Questi risultati permettono di concludere che il nuovo metodo non è allineato con quello di riferimento e richiederebbe modifiche per ottimizzare le qualità analitiche per la valutazione di livelli così bassi di leucociti in matrici complesse come i concentrati piastrini ed eritrocitari.
In conclusione questo metodo risulterebbe accettabile nel classificare i concentrati eritrocitari, mentre potrebbe essere impiegato come metodo di screening sui concentrati piastrinici per selezionare quelli che non necessitano di una rivalutazione col Leucocount. Naturalmente sarebbe necessario uno studio su un numero maggiore di unità per confermare queste osservazioni.
L’utilizzo di un sistema automatico per il monitoraggio della leucodeplezione negli
emocomponenti con l’utilizzo di una piattaforma analitica come il Sysmex XN-9000 sempre attiva permetterebbe di snellire questa fase del CQI. L’analisi non richiedendo particolari fasi di pre-trattamento del campione e calcolo dei risultati potrebbe essere gestita da qualunque operatore fornendo risultati rapidamente. I campioni risultati non conformi (34% per il nostro studio) necessiterebbero comunque di una rivalutazione successiva con il Leucocount.
I vantaggi sarebbero rappresentati da una riduzione dei costi complessivi e dalla possibilità di avere la maggioranza delle unità già controllate prima del loro impiego.
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