Analisi Bioinformatica

Nell’uomo, il gene di SCD1 è collocato sul cromosoma 10 (chr10: q24.31), è composto da 6 esoni che formano un trascritto di 5,362 bps (www.ensambl.org). Allo scopo di verificare l’esistenza dei TFBS sul promotore di SCD1, è stata selezionata la regione genomica compresa -961/+1 bp dal sito d’inizio della trascrizione (5’UTR) usando i database: ProScan v1.7; Genome Broswer e biogrid-LASAGNA. I TFs individuati potrebbero assumere un ruolo cruciale nella regolazione dell’espressione di SCD1 nel tumore al polmone, e sono: SREBP1, NF-YA, NF-YB, c-MYC e NF-kB. L’analisi bioinformatica ha permesso di individuare i putativi siti di legame altamente conservati dei TFs, le sequenze TATA box e CAAT box, oltre alla presenza di elementi regolatori associati alla RNA polimerasi II. I potenziali TFBS stati identificati usando dati di bioinformatica di ChIP-seq (www.genome.ucsc.edu). Il tool di Genome Broswer fornisce informazioni di ChIP-seq (www.genome.ucsc.edu/) ottenute analizzati i picchi di 161 TFs, derivante da 91 tipi di cellule, combinati in cluster per produrre una schematizzazione che mostra le regioni di occupazione per ogni fattore trascrizionale sul genoma (Bailey et al., 2013; Ma & Wong, 2011). L’algoritmo professionale, utilizzato per la predizione dell’allineamento dei TFBS, è stato effettuato con LASAGNA (lenght-Awarr Site Alignment Guided by Nucleotide

Association) SEARCH 2.0 (http://biogrid-

lasagna.engr.uconn.edu/lasagna_search/) (Lee & Huang, 2014). L’algoritmo si

basa sull’ipotesi che i siti di legame di un TFs condividono una breve sequenza altamente conservata (Lee & Huang, 2013). La sequenza del promotore di SCD1 collocata sul chr10: 100,347,124-100,364,834 è presente in GenBank® Nucleotide Sequence Database tramite numero identificativo AF320307 (Figura 17).

Figura 17. Analisi bioinformatica predittiva dei siti di legame dei fattori trascrizionali sul promotore di SCD1. (a) Il gene di SCD1 è localizzato sul cromosoma 10 (chr10:100,347,124-100,364,834). Con il database bioinformatici (http//genome.ucsc.edu/ e www.ensembl.org) è stato osservato che il gene di SCD1 è lungo 17,71 Kb, è composto da 6 esoni che formano un trascritto di 5,362 bps e una proteina di 359 residui. (b) Dati di ChIP- seq presenti su Genome Broswer (http//genome.ucsc.edu/) sul promotore di SCD1 (chr10: q24.31) individuano i TFs: SREBP1, NF-YA; Analisi dei siti di legame dei Fattori Trascrizionali sul promotore di SCD1.

Per la caratterizzazione funzionale del promotore del gene SCD1, in particolare, per identificare i TFBS cruciali per la regolazione di SCD1 è stata utilizzata la linea stabile di adenocarcinoma del polmone NCI-H460. Per validare i putativi TFBS è stata utilizzata la tecnica dell’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) nelle due condizioni di 2D e 3D di coltura. Le prime prove sperimentali sono volte alla messa a punto del protocollo d’immunoprecipitazione, nello specifico nella fase di sonicazione poiché le due condizioni di coltura presentano dei tempi differenti di frammentazione della cromatina. Infatti, per ottenere frammenti di 200-500 bp, le cellule 3D hanno necessità di ulteriori 10 cicli di sonicazione rispetto alle cellule in 2D, perché gli sferoidi sono caratterizzati da una membrana cellulare più spessa (Figura 18 a). Prima di procedere con la ChIP per i TFs identificati, è stato indispensabile verificare l’attività trascrizionale della regione del promotore selezionata nella linea NCI-H460. I risultati ottenuti mostrano sotto forma d’istogramma, l’arricchimento cromatinico normalizzato rispetto all’Input e alle IgG, nel nostro modello biologico. Per questo motivo sono stati analizzati, mediante qPCR, i livelli di arricchimento cromatinico di RNA

453); PR_3 (-451/-225); PR_4 (-271/-117); PR_5 (-135/-1). Il controllo negativo è rappresentato da IR (chr10:134795784-134796529) (Figura 18 b). È stata effettuata la ChIP per la Polimerasi II, necessaria per constatare e misurare l’attività trascrizionale nella regione del promotore di SCD1.

Nella condizione di coltura in 3D, l’analisi mostra un’intensa attività trascrizionale nella sequenza genomica target. L’analisi di ChiP anti-H3K4me3 ha lo scopo di studiare le modificazioni istoniche correlate all’attività trascrizionale nelle due condizioni di coltura. Complessivamente, i risultati ottenuti dell’analisi dell’arricchimento cromatinico mostrano una struttura cromatinica accessibile ai complessi trascrizionali, in entrambe le condizioni di coltura, in tutta la regione di promotore studiata. Il profilo epigenetico legato all’arricchimento per H3K4me3 è associato ad un aumento di trimetilazione della cromatina nella condizione in 3D nella PR_3. I risultati riconducibili all’apertura cromatinica, ottenuti tramite ChIP anti-Polimerasi II ed anti-H3K4me3, è tale da confermare un’intensa attività trascrizionale nella regione del promotore di SCD1 nelle condizioni di cultura in 2D e in 3D (Figura 18 c).

Figura 18. Approccio allo studio dei TFBS in cellule 2D e 3D di adenocarcinoma del polmone. (a) Schema del protocollo eseguito per l’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e dell’analisi dell’arricchimento della cromatina mediante qPCR. (b) Schema della suddivisione della sequenza del promotore (-921/-1 bp) in cinque regioni (PR) per effettuare l’analisi della ChiP mediante qPCR. (c) Analisi dell’arricchimento della cromatina per valutare l’attività trascrizionale della regione del promotore selezionata, mediante ChIP anti- Pol II in cellule 3D, utilizzando il promotore della GAPDH come regione intergenica (controllo negativo). Mentre, la ChIP anti-H3K4me3 è stata effettuata in cellule cresciute in condizioni di 2D e 3D ed è stata scelta la regione telomerica del cromosoma 10 come regione intergenica (IR) o controllo negativo. L’esperimento è stato ripetuto in duplicato.

Allo scopo di valutare se i TFs presentano dei siti di legame sulla sequenza del promotore di SCD1, sono state eseguite le ChIP per SREPB1c, NF-YB, NF-YA, NF-kB e c-MYC, e analizzate le cinque regioni in cui è stato suddiviso il promotore, tramite qPCR. La ChIP, effettuata con l’anticorpo che riconosce la proteina SREPB1c, mostra un arricchimento cromatinico del fattore trascrizionale in 2 porzioni (PR_1 e PR_3) esclusivamente nella condizione di coltura in 3D (Figura 19 a). L’arricchimento della cromatina misurato per NF-YB è presente esclusivamente nella condizione di coltura in 2D (PR_1 e PR_2) (Figura 19 b). Al contrario, NF-YA ha dei potenziali siti di legale nelle zone del promotore PR_2 e PR_5 nelle cellule 3D (Figura 19 c). La validazione della ChIP anti-NF-kB mostra una situazione piuttosto eterogenea, poiché presenta due porzioni di arricchimento cromatinico nelle cellule 3D (PR_1 e PR_3) e un’unica porzione in cui ci sono siti di legame del TF sulle cellule 2D (PR_5) (Figura 19 d). Infine, è stata comparata l’analisi dei livelli cromatinici per c-MYC delle 2D vs 3D, da cui è possibile osservare che entrambe le condizioni di coltura hanno dei siti di legame sul promotore di SCD1, ma le cellule 3D mostrano un arricchimento preponderante rispetto alle 2D e agli altri TFs (Figura 19 e).

Figura 19. ChIP qPCR dei Fattori Trascrizionali nella linea stabile NCI-H460 in condizioni di coltura in 2D e 3D. (a) Analisi dell’arricchimento della cromatina per valutare l’attività trascrizionale della regione del promotore mediante ChIP anti-SREPB1c in cellule cresciute in condizioni di 2D e 3D. (b) ChIP qPCR anti-NF-YB mostra arricchimento cromatinico esclusivamente in cellule cresciute in condizioni di 2D. (c) ChIP qPCR anti-NF-YA presenta l’arricchimento del TF sulla cromatina solamente in cellule cresciute in condizioni di 3D. (d) ChIP qPCR anti-NF-kB mostra arricchimento cromatinico sono in cellule cresciute in condizioni di 2D e 3D. (e) ChIP qPCR anti-c-MYC mostra arricchimento della cromatina eterogeneo sia in cellule cresciute in condizioni di 2D che in 3D. La regione intergenica (IR) o controllo negativo è stata scelta la regione telomerica del cromosoma 10 (chr10:134795784-134796529). (f) Schema riassuntivo della ChIP qPCR in cui si evidenzia il notevole arricchimento della cromatina nella condizione di coltura in 3D rispetto alla 2D. Sono individuabili i TFs e il corrispondente valore dell’arricchimento cromatinico eseguito mediante ChIP qPCR. L’esperimento è stato ripetuto in duplicato.

Considerando i dati ottenuti per ChIP qPCR sulla linea NCI-H460, in condizioni di cultura in 2D e in 3D, è possibile osservare un notevole e significativo arricchimento cromatinico dei siti di legame dei fattori trascrizionali, SREPB1, NF-YA e c-MYC, nella regione del promotore di SCD1 nella condizione in 3D (Figura 19 f).

5.3.2 Il silenziamento genico dei Fattori Trascrizionali modula