2.2. Risultati e discussioni
2.2.8. Analisi cinetica delle fasi
Per determinare il fattore limitante il processo di rilascio dalle NP, la dialisi fu interrotta dopo prestabiliti intervalli di tempo e a ciascuno di tali tempi fu determinata la frazione di farmaco passata nella fase ricevente (FFR), quella presente nella fase donatrice ma esterna alle nanoparticelle (FFD) e quella ancora associata alle nanoparticelle (FNP).
I dati riportati in Figura 17 indicano che il rilascio del farmaco dalle NP era completo dopo 180 min (3 h). Ciò spiega la ragione per cui non si osservano sostanziali differenze nei profili di rilascio di 5-FU dagli idrogeli e dagli idrogeli contenenti le NP. Tuttavia possiamo ipotizzare che le NP una volta internalizzate nelle cellule corneali, potrebbero funzionare da riserva di 5-FU. Per questa ragione i sistemi gelificanti in situ contenenti NP potrebbero dar luogo al prolungamento dell’azione di 5-FU nell’umore acqueo.
2.2.9. Misurazione della penetrazione intraoculare del
5-FU
Nella Figura 18 sono riportati i grafici dell’andamento della concentrazione di 5-FU nell’umore acqueo dell’occhio del coniglio vs. tempo dopo somministrazione della soluzione a base di N+Ch50 (20%) in confronto al riferimento costituito da una soluzione di 5-FU in TP pH 7.4 isotonica. I dati riportati sono preliminari, infatti deve essere completato il profilo relativo alla formulazione gelificante facendo prelievi a tempi più lunghi fino alla scomparsa del farmaco dall’umore acqueo. Inoltre dovrà essere studiato anche il profilo relativo alla stessa formulazione gelificante in situ contenente le NP. I dati preliminari mostrano per la formulazione gelificante in situ un andamento simile a quelli già ottenuti con altri idrogeli,
49 dimostrando che in effetti la formulazione gelifica nell’occhio del coniglio. Inoltre si osserva un netto prolungamento dell’azione di 5-FU nell’umore acqueo ed un conseguente aumento dell’area sotto la curva e quindi della biodisponibilità di 5-FU nell’umore acqueo.
50
CAPITOLO 3
CONCLUSIONI
Si sono ottenuti idrogeli termosensibili a partire da soluzioni di chitosano (Ch) e suoi derivati N+Ch e N+ChSH usando β-GP come agente gelificante. Gli idrogeli gelificavano nell’intervallo 30-35 °C e solo in particolari condizioni, cioè, quando il pH delle soluzioni, dopo aggiunta di β-GP era circa 7. Nanoparticelle di adeguate dimensioni sono state ottenute mediante reticolazione ionotropica del chitosano con acido ialuronico depolimerizzato. Le nanoparticelle erano abbastanza stabili per quanto riguarda le dimensioni, immediatamente dopo la loro preparazione e dopo ridispersione dei rispettivi liofilizzati grazie all’aggiunta di trealosio 5% (w/v). Studi di interazione farmaco-nanoparticelle hanno dimostrato una significativa interazione del 5-FU con la superficie nanoparticellare sebbene il rilascio del farmaco delle nanoparticelle fosse completo dopo 3h. Studi di interazione farmaco-polimero hanno dimostrato che l’affinità del 5-FU con i componenti della miscela polimerica aumentava all’aumentare della concentrazione dei derivati N+Ch50 ed era molto più alta alla massima concentrazione testata. Il rilascio di 5-FU dagli idrogeli era più lento nel caso degli idrogeli in cui si osservava una maggiore interazione del farmaco con i componenti della miscela polimerica soprattutto quando sono stati introdotti negli idrogeli stessi nanoparticelle medicate con 5-FU. Questi risultati suggeriscono che idrogeli termosensibili a base di chitosano e suoi derivati contenenti
51 nanoparticelle medicate hanno le caratteristiche sia degli idrogeli sia delle nanoparticelle. Infatti, tali idrogeli, oltre ad essere mucoadesivi, biocompatibili e non tossici possiedono una più lunga durata di azione grazie alla presenza delle nanoparticelle che possono essere indirizzate attivamente o passivamente al desiderato sito bersaglio.
Tali sistemi gelificanti in situ ottenuti a partire da chitosano e suoi derivati contenenti 5-FU hanno mantenuto il 5-FU nel fluido lacrimale per tempi più lunghi rispetto alle gocce tradizionali di fatto aumentando la biodisponibilità del farmaco nell’umore acqueo.
52
Figure e tabelle
Tabella 4.1: Grado di acetilazione (GA), grado di sostituzione (GS), rapporto tra atomi di azoto quaternari e terziari (n), grado di sostituzione dei gruppi tiolici (GS tioli) e densità di carica positiva (DC)a. Ciascun valore rappresenta la media di almeno tre preparazioni.
Polimero GA (%±DS) GS (%±DS) n±DS GS tioli (%±DS) (DC) a N+Ch60 14.9±0.5 59.1±3.1 2.0±0.1 - 1.2 N+Ch50 14.3±0.5 16.2±0.9 4.7±0.2 - 0.8 N+Ch60SH 1.1±0.5 N+Ch50SH 1.0±0.6
anumero di ioni ammonio quaternario per unità di ripetizione
Tabella 4.2: Dimensioni medie delle nanoparticelle determinate immediatamente dopo preparazione e dopo rigenerazione dei loro liofilizzati e relative Efficienze di intrappolamento (sigla, EI).
Dimensioni, nm e PI±DS preparate di fresco Dimensioni, nm e PI±DS dopo rigenerazione dei liofilizzati EI ± DS 285.6 ± 36.1 0.420 ± 0.05 341.5 ± 15.2 0.385 ± 0.45 36.6 ± 3.1
53 Tabella 4.3: Dati relativi agli esperimenti di dialisi differenziale. Concentrazione iniziale di 5-FU nel gel, 1.25 mg/mL.
Sistema Concentrazione di equilibrio in TF x 102, mg/mL r2 Ch 16.1 0.997 N+Ch60 (10%) 6.1 0.997 N+Ch60 (15%) 6.5 0.999 N+Ch60 (20%) 6.7 0.991 N+Ch60SH (10%) 7.9 0.998 N+Ch60SH (15%) 6.7 0.999 N+Ch60SH (20%) 7.1 0.999 N+Ch50 (10%) 8.5 0.997 N+Ch50 (15%) 5.5 0.993 N+Ch50 (20%) 4.6 0.999 N+Ch50SH (10%) 15.7 0.995 N+Ch50SH (15%) 12.8 0.993 N+Ch50SH (20%) 12.9 0.999
54 Tabella 4.4: Percentuale cumulativa di 5-FU rilasciato (% ril.) al tempo t=2 ore (caso dei geli medicati, a) e al tempo t=5 ore (caso dei geli contenenti nanoparticelle medicate, b). Caso a Sistema % ril. ± DS Ch 83 ± 3.6 N+Ch60 (10%) 81.7 ± 3.8 N+Ch60 (15%) 85.3 ± 3.1 N+Ch60 (20%) 66.0 ± 2.8 N+Ch60SH (10%) 89.9 ± 2.2 N+Ch60SH (15%) 79.2 ± 2.5 N+Ch60SH (20%) 68.0 ± 2.6 N+Ch50 (10%) 72.2 ± 3.9 N+Ch50 (15%) 77.7 ± 3.1 N+Ch50 (20%) 65.1 ± 2.1 N+Ch50SH (10%) 88 ± 2.0 N+Ch50SH (15%) 89 ± 2.3 N+Ch50SH (20%) 63.4 ± 3.6
55 Caso b Sistema % ril. ± DS Ch 82.8 ± 4.7 N+Ch60 (10%) 79.6 ± 3.9 N+Ch60 (15%) 78.7 ± 3.8 N+Ch60 (20%) 78.9 ± 0.6 N+Ch60SH (10%) 82.2 ± 4.2 N+Ch60SH (15%) 86 ±3.9 N+Ch60SH (20%) 76.2 ± 2.9 N+Ch50 (10%) 84.1 ± 7.6 N+Ch50 (15%) 69.5 ± 1.5 N+Ch50 (20%) 59.5 ± 0.9 N+Ch50SH (10%) 86.5 ± 1.8 N+Ch50SH (15%) 87.9 ± 2.3 N+Ch50SH (20%) 78.4 ± 3.8
56 Figura 10: Foto di NP fluorescenti ottenute con il microscopio confocale (a, b scala 10 µm, c scala 1 µm)
a) b)
c)
57 Figura 12: Frazione di 5-FU rilasciata vs tempo da geli a base di Ch e dei derivati N+Ch50 (a) e da geli a base di Ch e dei derivati N+Ch50 contenenti
nanoparticelle medicate (b).
Figura 13: Frazione di 5-FU rilasciata vs tempo da geli a base di Ch e dei derivati N+Ch60 (a) e da geli a base di Ch e dei derivati N+Ch60 contenenti
58 Figura 14: Frazione di 5-FU rilasciata vs tempo da geli a base di Ch e dei derivati N+Ch50SH (a) e da geli a base di Ch e dei derivati N+Ch50SH
contenenti nanoparticelle medicate (b).
Figura 15: Frazione di 5-FU rilasciata vs tempo da geli a base di Ch e dei derivati N+Ch60SH (a) e da geli a base di Ch e dei derivati N+Ch60SH
59 Figura 16: Frazione di 5-FU nella fase ricevente della dialisi vs tempo. Fase donatrice: soluzione contenente il farmaco (controllo); soluzione contenente farmaco e chitosano (5-FU Ch) ; dispersione nanoparticellare (NP). Media ± DS di 3 esperimenti.
Tabella 4.5: Parametri derivanti dall’analisi dei dati in Figura 10 mediante l’Equazione (1). Substrato Costante di velocitàah-1, ± DS r 2 Interazioneb (%) Controllo 0.8410 ± 0.02* 0.999 − 5-FU Ch 0.9142 ± 0.052 0.994 8.7 NP 0.5435 ± 0.019 0.996 35.4 a
Modulo della pendenza della retta. bFrazione di farmaco legata reversibilmente.
0 1 2 3 4 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 ore ln [ (C d /C d 0 ) x 1 0 0 ] Controllo NP 5-FU Ch
60 Figura 17: Cinetica del 5-FU in ogni fase della dialisi, in presenza di Ch: dipersione nanoparticellare (FNP); fase donatrice esterna alle nanoparticelle (FFD); fase ricevente (FFR). Media ±DS di 3 esperimenti.
61 Figura 18: Concentrazione di 5-FU nell’umore acqueo vs tempo dopo instillazione di una goccia oftalmica (50 μL) mediante differenti veicoli.
0 30 60 90 120 150 180 210 240 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 minuti c o n c e n tr a z io n e µ g /m L Controllo N+Ch50 (20%)
62
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