Analisi citofluorimetrica: effetto di etanercept e acitretina sui linfociti T lesionali nei pazienti con psorias

Analogamente a quanto riscontrato a livello circolante, anche a livello delle lesioni cutanee psoriasiche è stata osservata una riduzione significativa rispetto ai valori basali dei linfociti Th17, caratterizzati dal fenotipo IL-17+IFN-γ− CD4+, dopo il trattamento eseguito con etanercept (p = 0.046), mentre nessuna differenza è stata riscontrata dopo acitretina (Tab. 3; Fig. 6A). In Fig. 7, sono riportati gli istogrammi relativi ai linfociti secernenti IL-17 di un caso rappresentativo. Inoltre, dopo 12 settimane di terapia, la percentuale di linfociti T IL-17+ era significativamente inferiore nei pazienti trattati con etanercept rispetto a quelli trattati con acitretina (p = 0.001). Allo stesso modo, la proporzione dei linfociti CD4+ esprimenti IL-8 era significativamente ridotta rispetto ai valori pre-terapia nei pazienti trattati con etanercept (p = 0.049) ma non con acitretina (Fig. 6A). Altro dato interessante è risultata essere la capacità di etanercept di incrementare le percentuali dei linfociti Tr1 IL-10+ nella cute dei pazienti psoriasici rispetto ai valori dimostrati prima della terapia (p = 0.014), cosa che invece non è stata riscontrata dopo la terapia con acitretina (Fig. 6A). In accordo con tale risultato, la percentuale di tali cellule era statisticamente più elevata nel gruppo trattato con etanercept rispetto a quello trattato con acitretina (p = 0.01). Le percentuali dei

linfociti T IL-17+IFN-γ+, IFN-γ+IL-17−, e IL-4+, invece, sono rimaste inalterate dopo entrambi i trattamenti (Fig. 6A).

Abbiamo in seguito valutato se tali effetti esercitati da etanercept e acitretina sui linfociti CD4+ presenti nelle lesioni cutanee della psoriasi potessero essere riscontrati anche a carico dei linfociti CD8+ (Tab. 3; Fig. 6B). In accordo con i risultati ottenuti in precedenza, la terapia con etanercept si è dimostrata capace di ridurre significativamente, rispetto ai valori ottenuti nei pazienti non trattati, le percentuali dei linfociti T CD8+ secernenti IL-17- e IL-17/IFN-γ- (p = 0.049 e p = 0.024, rispettivamente), mentre la terapia con acitretina non ha mostrato tale attività. Da sottolineare che il gruppo trattato con etanercept mostrava valori di linfociti T IL-17+IFN-γ− e IL-17+IFN-γ+ sovrapponibili a quelli riscontrati nelle lesioni cutanee di DA e significativamente inferiori rispetto ai pazienti trattati con acitretina (p < 0.001 e p = 0.003, rispettivamente). Come osservato in precedenza, anche i linfociti T CD8+ secernenti IL-8 erano significativamente ridotti a livello cutaneo dopo il trattamento con etanercept (p = 0.007), ma non dopo quello con acitretina. Nessuno dei due farmaci è stato in grado di modificare le percentuali dei linfociti CD8+ lesionali secernenti IFN-γ, IL-4 o IL-10.

Capitolo 6

Discussione

La psoriasi è una malattia infiammatoria cronica cutanea a patogenesi immunomediata in cui è stato dimostrato un ruolo patogenetico determinante da parte dei linfociti T. Negli ultimi anni numerosi studi hanno tentato di chiarire i meccanismi molecolari alla base della malattia, con particolare riferimento al ruolo di alcune popolazioni linfocitarie potenzialmente coinvolte nella risposta infiammatoria alla base delle manifestazioni cutanee della psoriasi.

In particolare, numerosi dati sperimentali hanno inizialmente dimostrato come i linfociti T polarizzati in senso Th1 fossero in grado di promuovere e mantenere la flogosi riscontrata nella cute lesionale dei pazienti psoriasici. Come rilevato in precedenza, tuttavia, negli ultimi anni è emerso che un’altra popolazione linfocitaria recentemente identificata, quella dei linfociti Th17, sia determinante per lo sviluppo della malattia mediante la secrezione di citochine capaci di attività pro-infiammatoria, tra cui l’IL-17, e citochine in grado di promuovere l’iperproliferazione e l’alterata differenziazione dei cheratinociti, come l’IL-22.

Numerosi elementi rimangono tuttavia da chiarire relativamente al ruolo dei linfociti T nella patogenesi della psoriasi. In particolare, le conoscenze relative alla correlazione delle varie popolazioni linfocitarie potenzialmente implicate

nella malattia (Th1, Th2, Th17, Tregs) con la gravità delle manifestazioni cliniche e con la risposta alle terapie, tra cui le moderne terapie biologiche basate sull’inibizione del TNF-α, sono ancora estremamente limitate.

Nel presente studio, abbiamo approfondito tali argomenti mediante una accurata analisi dei linfociti T appartenenti a vari pattern immunologici, con particolare attenzione al pattern Th17, nei pazienti con psoriasi. Tali indagini sono state condotte sia a livello della cute lesionale che del sangue circolante prima e dopo il trattamento con un farmaco anti-TNFα, l’etanercept, e con un farmaco di controllo di provata efficacia nella terapia della psoriasi, l’acitretina, appartenente alla classe dei retinoidi.

Innanzi tutto l’indagine clinica, valutata tramite il calcolo del PASI prima e dopo un trattamento della durata di 3 settimane, ha evidenziato come entrambi i farmaci risultassero significativamente efficaci nella riduzione delle manifestazioni psoriasiche. L’etanercept, tuttavia, determinava una risposta clinica significativamente maggiore rispetto all’acitretina, dimostrando di avere una efficacia superiore come già evidenziato in studi precedenti.18,19

Successivamente, nella prima fase di tipo sperimentale dello studio, sono state condotte un’indagine immunoistochimica volta alla valutazione dei marcatori specifici dei linfociti Th17 e dei loro precursori (in particolare RORγt, CD161 e CCR6) nelle lesioni cutanee dei pazienti psoriasici18 e un’indagine immunoenzimatica per l’analisi sierologica delle principali citochine prodotte da tali linfociti Th17 (IL-17, IL-22, IL23).19 Tali indagini sono state eseguite in pazienti psoriasici non in trattamento e dopo terapia con etanercept e acitretina.

I risultati dell’analisi immunoistochimica, in seguito confermati da studi successivi, hanno dimostrato che i linfociti Th17 e i loro precursori sono presenti nella psoriasi e il loro numero è significativamente maggiore rispetto alla DA, altra malattia cronica in cui i linfociti T svolgono un ruolo primario dal punto di vista patogenetico. Dopo il trattamento con etanercept, il numero di tali risultava significativamente inferiore rispetto a quello riscontrato nei pazienti trattati con acitretina, suggerendo un’attività inibitoria specifica di tale farmaco sul pattern dei linfociti Th17.18

Analogamente, il nostro studio sierologico ha dimostrato nei pazienti psoriasici non trattati un aumento delle citochine secrete dai linfociti Th17, che si riducevano fino a raggiungere valori comparabili a quelli dei soggetti sani di controllo esclusivamente nel gruppo trattato con etanercept.19

Tali risultati hanno rappresentato quindi una conferma del ruolo dei linfociti Th17 nella patogenesi della psoriasi e del possibile effetto inibitorio specifico di etanercept su tale popolazione cellulare, costituendo quindi una premessa per la seconda parte di tipo sperimentale di questa ricerca.

In quest’ultima, è stata condotta un’indagine di tipo citofluorimetrico sulle popolazioni linfocitarie T CD4+ e CD8+ in grado di esprimere IL-17, IFN-γ, IL-4, IL-10 e IL-8 sia a livello cutaneo che del sangue circolante nei pazienti con psoriasi volgare. Anche in questo caso sono stati valutati gli effetti di etanercept e, come terapia di controllo, di acitretina, sulle variazioni dinamiche di tali cellule.

Per prima cosa abbiamo valutato la percentuale delle varie sottopopolazioni linfocitarie T in 30 pazienti con psoriasi non trattati, confrontando i risultati con quelli ottenuti in soggetti sani di controllo e in pazienti con DA. Il dato principale

emerso dalla nostra analisi è stata la presenza di un numero significativamente elevato di linfociti Th17 e Th17/Th1 nelle lesioni cutanee e nel sangue circolante di pazienti con psoriasi rispetto ai controlli, dato che ci ha permesso di confermare il ruolo di tali cellule nella patogenesi della malattia, come riportato in numerosi studi della Letteratura.74-79 In particolare, mentre I linfociti Th17 e Th17/Th1 localizzati a livello cutaneo svolgono probabilmente un ruolo di primo piano nell’induzione delle lesioni psoriasiche attraverso la produzione di numerose citochine patogenetiche tra cui l’IL-8 e le già ricordate IL-17 e IL-22, quelli riscontrati a livello circolante possono rappresentare sia cellule in transito da o verso la cute,20 sia cellule responsabili della flogosi di tipo sistemico riscontrata comunemente nei pazienti psoriasici, idi cui le più comuni espressioni fenotipiche di tipo patologico sono costituite dalla psoriasi artropatica e dell’aterosclerosi.83 Inoltre, pur in contrasto con un precedente lavoro,20 ma in accordo con Zhang e collaboratori,84 il nostro studio ha dimostrato una diretta correlazione tra le percentuali dei linfociti T CD4+ presenti a livello lesionale e a livello circolante in grado di produrre IL-17 da sola (linfociti Th17) o in combinazione con IFN-γ (linfociti Th17/Th1) e la gravità della psoriasi espressa mediante il valore di PASI. Da sottolineare come tale dato rappresenti una ulteriore conferma del rilevante ruolo patogenetico di queste due popolazioni linfocitarie nella patogenesi della malattia.

Analogamente a quanto riscontrato per i linfociti T CD4+, anche i linfociti T CD8+ con fenotipo Th17 e Th17/Th1 erano aumentati nella cute psoriasica rispetto a quella dei pazienti con DA utilizzati come controllo. In accordo con tali risultati, alcuni studi hanno recentemente dimostrato un incremento dei linfociti T CD8+ IL-17-secernenti nelle lesioni cutanee di pazienti con psoriasi,22,85

suggerendo che non solo i linfociti T helper CD4+, ma anche i linfociti T CD8+ siano responsabili delle alterazioni patogenetiche della cute psoriasica.

Altro risultato, ampiamente atteso, del nostro studio, che tra l’altro conferma un dato ormai acquisito della letteratura è stato il riscontro di ridotte percentuali di linfociti CD4+ e CD8+ IL-4-secernenti (pattern Th2) sia nella cute lesionale che nel sangue circolante dei pazienti psoriasici rispetto a quelli con DA, mentre non sono state evidenziate differenze nelle percentuali dei linfociti T IFN-γ+ tra i pazienti con psoriasi, DA e i controlli sani. Nonostante possa apparire a prima vista piuttosto sorprendente, quest’ultimo risultato suggerisce che il peso relativo della flogosi mediata dai linfociti Th1 nella patogenei della psoriasi vada rivalutato alla luce delle recenti acquisizioni sui linfociti Th17, confermando che questi ultimi rappresentano probabilmente i principali protagonisti del processo immunologico che determina lo sviluppo della malattia. In accordo con questa teoria, molto recentemente Res et al22 hanno dimostrato una percentuale sovrapponibile di linfociti T IFN-γ+ presenti a livello dermico in pazienti psoriasici e in controlli sani, nonostante questi ultimi presentino un numero significativamente inferiore di linfociti T infiltranti la cute rispetto ai pazienti con psoriasi.

Infine, mentre alcuni studi hanno in precedenza analizzato il ruolo dei linfociti natural Treg Foxp3+ nella psoriasi,23,84,86-88 per la prima volta nella presente ricerca è stata valutata la popolazione dei linfociti Treg IL-10-secernenti, appartenenti al sottogruppo dei linfociti Tr1, a livello del sangue circolante e delle lesioni cutanee di pazienti con psoriasi. Nonostante il fatto che, sia a livello ematico che a livello cutaneo, non siano state individuate differenze relative alle percentuali dei linfociti CD4+ e CD8+ in grado di produrre IL-10 tra pazienti con

psoriasi, pazienti con DA e controlli sani, è stata dimostrata una correlazione negativa tra la percentuale dei linfociti CD4+ IL-10-secernenti presenti a livello lesionale e la gravità delle manifestazioni cutanee della psoriasi calcolata mediante il PASI; tale dato suggerisce quindi che un deficit relativo della popolazione linfocitaria di tipo regolatorio dei Tr1 potrebbe svolgere un ruolo nella patogenesi delle lesioni psoriasiche. Altro dato interessante in accordo con tale ipotesi è risultato essere la correlazione positiva del rapporto tra cellule IL- 17+ e IL-10+, definito come IL-17+/IL-10+ cell ratio, con l’estensione delle lesioni cutanee. Dal punto di vista concettuale, un aumento di tale rapporto indica una relativa maggiore presenza di linfociti T effettori patogeneticamente attivi (in questo caso linfociti Th17 IL-17+) con una concomitante riduzione di linfociti Treg con funzione anti-infiammatoria e immunosoppressiva (in questo caso linfociti Tr1 IL10+); come diretta conseguenza, risulta che la malattia si presenta con una maggiore estensione e gravità quando i linfociti Tr1 sono relativamente ridotti e quindi non in grado di controbilanciare l’aumentata attività patogenetica dei linfociti Th17.

Mentre numerosi studi hanno valutato i linfociti T in pazienti psoriasici non trattati, esistono pochi dati relative alle modificazioni di tali popolazioni cellulari dopo la terapia e, in particolare, dopo un trattamento con inibitori del TNF-α. Per quanto riguarda I linfociti Th17, Zaba e collaboratori,75 valutando la cute lesionale e non lesionale di 20 pazienti con psoriasi, hanno dimostrato che etanercept è in grado di ridurre sia l’espressione di mediatori pro-infiammatori prodotti dalle cellule dendritiche che stimolano la proliferazione dei linfociti Th17 (in particolare l’IL-23), sia le molecole effettrici prodotte dai linfociti Th17 stessi (tra cui IL-17, IL-22, CC chemokine ligand 20, e β-defensina 4). Lo stesso gruppo

ha dimostrato che, in 15 pazienti con psoriasi, la risposta ad etanercept era correlata all’inibizione dell’espressione dei geni associatial pattern Th17.89 Quaglino e collaboratori88 hanno dimostrato, in una coorte di 19 pazienti psoriasici, una riduzione dell’espressione dell’RNA messaggero da parte di geni relativi ai pattern Th1 e Th17 a seguito di un trattamento di 12 settimane con etanercept. Infine Kagami et al, analizzando 5 pazienti con psoriasi trattati con infliximab, hanno dimostrato una riduzione dei linfociti Th17 a livello circolante.20

In accordo con questi risultati della Letteratura, nel presente studio abbiamo dimostrato che una terapia con etanercept, al contrario di quella con acitretina, è in grado di ridurre in modo significativo la percentuale dei linfociti Th17 e dei linfociti CD8+ IL-17-secernenti nella cute e nel sangue circolante dei pazienti con psoriasi. Da sottolineare come, dopo 12 settimane di terapia, nei pazienti psoriasici la proporzione dei linfociti IL-17+ era sovrapponibile a quella dei controlli sani.

Nel complesso i nostri risultati suggeriscono che, nonostante una dimostrata efficacia di entrambi i farmaci nella riduzione delle lesioni cutanee psoriasiche, solo etanercept è in grado di inibire specificamente il pathway linfocitario Th17, mentre l’efficacia di acitretina è probabilmente legata ad altri fattori, tra cui l’azione sulla proliferazione e la differenziazione cheratinocitaria. In particolare, gli effetti di etanercept sui linfociti Th17 possono essere spiegati dalla capacità di tale farmaco di inibire la maturazione delle cellule dendritiche e la loro produzione di citochine proinfiammatorie, determinando in questo modo una riduzione nell’attivazione e, probabilmente, nella proliferazione degli stessi linfociti Th17.75

Inoltre il TNF-α, che rappresenta la principale molecola bersaglio della terapia con etanercept, è collegato al pathway dei linfociti Th17 tramite due vie di segnale: una via diretta, in quanto in grado di indurre la secrezione di IL-17 da parte dei linfociti;90 una via indiretta, mediata dall’induzione della produzione di IL-1β che, a sua volta, è in grado di favorire la maturazione delle cellule dendritiche con conseguente produzione di IL-23, citochina chiave nella differenziazione dei linfociti T naïve in linfociti Th17.91 Di conseguenza, il blocco di TNF-α da parte di etanercept rappresenta una ulteriore spiegazione della riduzione dei linfociti T IL-17-secernenti a livello cutaneo e circolante nei pazienti con psoriasi.

Un altro punto interessante emerso dai nostri risultati è rappresentato dall’aumento delle percentuali dei linfociti Tr1 IL-10+ a livello della cute psoriasica dopo la terapia con etanercept, fenomeno che invece non è stato riscontrato nei pazienti trattati con acitretina. Dai dati in nostro possesso non è possible stabilire se etanercept è in grado di promuovere l’espansione della sottopopolazione Tr1 dei linfociti T regolatori, oppure se il loro incremento è secondario alla concomitante riduzione dei linfociti Th17. Alcuni studi recenti, tuttavia, hanno dimostrato che gli inibitori del TNF-α inducono un aumento del numero dei Tregs e una riduzione del rapporto tra linfociti T effettori e Treg, determinando quindi un complessivo effetto anti-infiammatorio.92-94 In accordo con tali lavori, nel nostro studio si osservava un elevato rapporto tra i linfociti T IL-17+ e IL-10+ nelle lesioni psoriasiche prima della terapia (IL-17+/IL-10+ ratio = 7), che si riduceva notevolmente dopo la terapia con etanercept (IL-17+/IL-10+ ratio = 1.1), mentre rimaneva pressochè inalterato nel gruppo trattato con acitretina (IL-17+/IL-10+ ratio = 6.6).

Infine, i nostri risultati hanno evidenziato anche una significativa riduzione nella percentuale dei linfociti T CD4+ e CD8+ in grado di produrre IL-8 sia a livello cutaneo che a livello circolante nei pazienti trattati con etanercept. Come è noto, l’IL-8 possiede una notevole attività chemiotattica nei confronti dei granulociti neutrofili, che rappresentano la principale popolazione cellulare riscontrata nelle lesioni psoriasiche in fase attiva.95,96 Dal momento che la produzione di tale citochina sembra essere indotta sia dal TNF-α che dall’IL-17,97 la riduzione delle percentuali dei linfociti T IL-8+ dopo il trattamento con etanercept, ma non dopo quello con acitretina, appare del tutto coerente e può essere considerato un ulteriore meccanismo attraverso il quale si giunge alla guarigione delle lesioni cutanee nei pazienti con psoriasi.

In conclusione, il nostro studio ha fornito ulteriori evidenze sul ruolo della popolazione dei linfociti Th17 nella patogenesi della psoriasi. Inoltre, i nostri risultati suggeriscono che etanercept è in grado di inibire tale pattern linfocitario in modo specifico, determinando inoltre una concomitante riduzione dell’espressione di IL-8, citochina chiave nella patogenesi delle lesioni cutanee della malattia, e del rapporto Th17/Tr1, spostando in senso tollerogenico e quindi anti-infiammatorio la risposta immunitaria presente nei pazienti psoriasici. Queste attività possono quindi contribuire alla comprovata efficacia di etanercept nel trattamento della psoriasi, suggerendone quindi l’utilizzo in altre malattie mediate dai linfociti Th17 e giustificandone la maggior attività terapeutica nei confronti di un farmaco tradizionalmente utilizzato nella psoriasi come l’acitretina.

Capitolo 7

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