Per la realizzazione dello studio comportamentale in Thalassoma pavo, sono state condotte quattro osservazioni giornaliere della durata di un ora cadauna, distribuite lungo l’arco della giornata, per ciascuna categoria sperimentale, mediante utilizzo di videocamera (Panasonic NV-7; Tokio, Japan). Nel caso di Carassius auratus, durante la fase dello screening preliminare, per tutti i farmaci testati gli animali sono stati osservati per tutta la prima ora post-trattamento, e con successive osservazioni della durata di 15 min durante la seconda, la quarta, la sesta e la ventiquattresima ora post-trattamento, mediante utilizzo di videocamera (Kodak EasyShare Z1275; Rochester, NY, USA). Le immagini acquisite sono state successivamente digitalizzate ed elaborate con l’ausilio di uno specifico software comportamentale (Etholog 2.2.5), che ha permesso di classificare il comportamento degli animali osservati in apposite categorie comportamentali, nonché di misurare con elevata precisione temporale la quantità di tempo trascorsa da ogni animale in ciascuna categoria comportamentale (Ottoni, 2005). Le categorie comportamentali prese in esame per questo studio riflettono il disegno sperimentale che ci si è proposti di realizzare in questo lavoro è sono state così classificate:
Nuoto (Free Swimming, FS): l’animale si presenta attivo nuotando all’interno dell’acquario e mostrando un atteggiamento esplorativo nello spazio a sua disposizione;
Stato di inattività (Rest, R): l’animale è quasi completamente immobile, salvo qualche lieve e momentaneo spostamento corporeo, tende ad adagiarsi sul fondo e ad appoggiarsi alle pareti laterali dell’acquario;
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Comportamento alimentare ed esplorativo (Swimming towards food, STF): l’animale nuota in direzione della superficie o del fondo dell’acquario manifestando il tipico atteggiamento esplorativo e di ricerca e cattura del cibo.
Quantità di cibo ingerita dall’animale: la quantità di cibo somministrata agli animali all’inizio di ogni sessione di osservazione è stata pesata su una bilancia analitica, ed il cibo non consumato alla fine della stessa sessione accuratamente rimosso dall’acquario e pesato.
3.8.1 T-maze test
L’utilizzo della metodica del T-maze ci ha consentito inoltre di analizzare le capacità di apprendimento e le capacità motivazionali di Carassius auratus, tramite l’analisi del condizionamento mediante l’associazione di un evento di “ricompensa” con stimoli positivi di natura spaziale e/o visiva , in maniera simile a quanto riportato per Danio rerio (Colwill et al., 2005). In questo studio è stato utilizzato un apparato costituito da un four-arm T-maze (Fig) adattato per il nostro modello sperimentale e costituito da un compartimento di start (40 x 40 cm), da un lungo corridoio (40 x 20 cm) e da 3 bracci di uguale lunghezza (20 x 20 cm) (Fig. 3.10). Come ricompensa, in questo lavoro sperimentale è stata scelta la disponibilità di cibo, infatti solo gli animali che rispondevano positivamente al processo di condizionamento avevano accesso al cibo, che veniva localizzato solo in uno delle tre braccia dell’apparato. Per verificare la natura degli stimoli in grado di indurre un condizionamento efficace nel nostro modello sperimentale, gli animali sono stati sottoposti a diversi stimoli associati a una ricompensa alimentare. Per questa fase dello studio, gli animali sono stati suddivisi in 3 gruppi sperimentali così classificati:
a) Animali condizionati in assenza di stimoli visivi con il cibo localizzato nel braccio destro o sinistro dell’apparato;
b) Animali in cui il braccio dell’apparato associato alla ricompensa alimentare era distinto dalla presenza di un faretto bianco che lo illuminava;
c) Animali le cui braccia del maze erano illuminate con faretti di diverso colore (rosso/blu) e di cui solo 1 era associato alla presenza della ricompensa alimentare.
La scelta di quale braccio del maze da associare alla ricompensa alimentare era soggettiva per ogni animale e adottata in seguito ad uno screening comportamentale in cui veniva verificata la preferenza di ciascuno animale, in seguito al quale il cibo veniva associato al braccio/stimolo di non preferenza. Il protocollo sperimentale per tale paradigma comportamentale prevedeva:
1) Una sessione di pre-training, in assenza di ogni stimolo, in cui i pesci erano lasciati liberi di muoversi nell’apparato per 10 min.
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2) Pre-test: gli animali venivano monitorati per 10 min nei quali veniva misurato tempo impiegato per raggiungere il braccio associato alla ricompensa alimentare (tempo di latenza), prima del condizionamento.
3) Training: 7 sessioni consecutive di 10 min cadauna in cui gli animali venivano condizionati ad associare 1 braccio del maze contraddistinto da stimolo spaziale o visivo con un rinforzo positivo fornito dalla presenza di cibo.
4) Test: in cui gli animali venivano monitorati per 10 min e le performance misurate come tempo di latenza.
Durante le sessioni di training e la sessione di trattamento gli animali erano posizionati nel compartimento di start che per un minuto veniva tenuto bloccato mediante l’utilizzo di una porta mobile che isolava il resto del four-arms T-maze, trascorso il quale la porta mobile del compartimento di start veniva rimossa e il pesce aveva libero accesso all’intero apparato per 10 minuti in modo da poter raggiungere il braccio dal maze associato allo stimolo condizionante e consumare la ricompensa alimentare ad esso associata. Durante tale tempo gli animali venivano monitorati al fine di verificare il tempo impiegato a raggiungere e consumare la ricompensa alimentare e quindi la forza del condizionamento operato.
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3.8.2 Conditioned Place Preference (CPP)
Il CPP è considerato un valido paradigma sperimentale per analizzare gli effetti dei differenti trattamenti farmacologici sui processi di ricompensa indotti dal cibo o dalle droghe di abuso non solo nei mammiferi (Tzschentke, 1998; Tzschentke, 2007), ma anche nei teleostei (Ninkovic e Bally-Cuif, 2006). Tale paradigma si basa sull’analisi degli effetti dei diversi trattamenti farmacologici sull’induzione di un processo di condizionamento, volto ad associare un evento di ricompensa/avversione ad una specifica sezione dell’apparato. L’apparato, nel nostro caso era costituito da un acquario di 150 L, suddiviso da 2 setti di plexiglas trasparenti, inseriti verticalmente, in tre sezioni di uguali dimensioni, di cui una centrale (start) e le due laterali contraddistinte illuminate da faretti di colore diverso (rosso/blu). Tutte le camere dell’apparato erano tra loro comunicanti così da permettere il libero movimento degli animali (Fig. 3.11). La scelta delle fonti luminose colorate come stimoli discriminanti tra i diversi comparti dell’apparato, e come stimoli condizionanti/discriminati si è basata sui risultati ottenuti al T-maze test. Il protocollo sperimentale di tale paradigma prevede:
1) Una sessione di pre-training, in cui gli animali sono liberi di esplorare l’apparato, privo di qualsiasi stimolo luminoso della durata di 15 min.
2) Determinazione del PP: gli animali sono posti nel compartimento di start, e lasciati liberi di muoversi nell’apparato per 15 min, in cui sono già presenti gli stimoli luminosi, e durante i quali viene misurato il tempo speso dagli animali in ogni compartimento dell’apparato associato ad uno specifico stimolo luminoso, al fine di determinare in quale di questi comporti ogni animale trascorre la maggior parte del proprio tempo.
3) Condizionamento: gli animali sono trasferiti in un nuovo acquario, dove sono condizionati ad associare lo stimolo visivo presente nel lato dell’apparato di non preferenza con la presenza di cibo, mediante l’attivazione di tale stimolo luminoso pochi secondi prima la somministrazione del cibo. Il segnale luminoso, specifico il comparto di preferenza degli animali veniva invece attivato casualmente lungo l’arco della giornata. Tale processo è stato ripetuto ad intervalli regolari per un totale di 8 sessione di condizionamento.
4) Test: gli animali sono nuovamente riportati nell’apparato, posti nel compartimento di start, e lasciati liberi di muoversi per 15 min in tutto l’apparato, in cui sono già presenti gli stimoli visivi. Durante questa fase viene misurato il tempo speso dagli animali in ogni compartimento dell’apparato, associato ad uno specifico stimolo luminoso, e l’efficacia del condizionamento espressa come % di cambio del PP (ΔPP).
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Per ogni trattamento testato, sono stati utilizzati 2 sottogruppi sperimentali di cui il primo veniva trattato i.p. con il farmaco di interesse ed il secondo sottogruppo riceveva un’iniezione i.p. di NaCl 0.9%, un’ora prima di ogni sessione di condizionamento.
Fig. 3.11 Figura rappresentativa dell’apparato per l’analisi del CPP