Analisi cromatografica dei campioni reali

A questo punto, dopo aver ottimizzato la separazione dei singoli analiti, si è analizzato il grezzo di reazione contenente i due monomeri, l’anisolo, l’iniziatore della polimerizzazione (HEBIB) ed altri cofattori come il DMSO, CuBr ed il Me6TREN. Il

grezzo di reazione è stato diluito in acetonitrile fino a raggiungere la concentrazione di circa 1,00 mg L-1. In Figura 40 è riportato il cromatogramma del grezzo ottenuto con le condizione precedentemente ottimizzate. Com’è possibile osservare dalla figura sotto riportata la fase mobile utilizzata non separa in modo adeguato gli analiti quando applicata al campione reale.

Figura 40: Cromatogramma del grezzo diluito in acetonitrile alla concentrazione di circa 1 mg/L. Fase mobile

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un tempo di ritenzione di 2,45 minuti, quello dell’anisolo di 2,62 minuti, mentre quello dello stirene di 2,77 minuti.

E’ quindi necessario utilizzare una fase mobile più polare. In Figura 41 si riporta l’analisi del grezzo ottenuto con la fase mobile così composta 80:20 (v/v) MetOH:H2O.

Figura 41: Cromatogramma deli grezzo diluito in acetonitrile alla concentrazione di 1,00 mg/L. Fase mobile

80:20 (v/v) MetOH:H2O. Cromatogramma estratto dal rivelatore DAD a 220nm. Il picco del metil

metacrilato mostra un tempo di ritenzione di 3,09 minuti, quello dell’anisolo di 4,05 minuti, mentre quello dello stirene è di 5,55 minuti.

Come si può notare dal cromatogramma sopra riportato l’aggiunta del 20 % d’acqua ha permesso la completa separazione dei tre analiti, dimostrando come sia indispensabile il suo utilizzo. Essendo la forma dei picchi non soddisfacente, si è provato a sostituire il metanolo con l’acetonitrile con però l’accortezza di aumentare la percentuale di acqua fino al 30 % per compensare la diversa polarità dei due solventi. Il cromatogramma riportato in Figura 42 mostra come l’ultima variazione della fase mobile abbia portato alla completa separazione dei tre analiti permettendone anche l’integrazione. La miscela 70:30 (v/v) acetonitrile:acqua è stata quindi scelta come fase mobile del metodo cromatografico per l’identificazione degli analiti dal grezzo di reazione.

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Figura 42: Cromatogramma del di grezzo diluito in acetonitrile alla concentrazione di 1,00 mg/L. Fase mobile

70:30 (v/v) ACN:H2O. Cromatogramma estratto dal rivelatore DAD a 220nm. Il picco del metil metacrilato

mostra un tempo di ritenzione di 3,23 minuti, quello dell’anisolo di 4,11 minuti, mentre quello dello stirene è di 5,73 minuti.

A questo punto sono state modificate le impostazione del rilevatori in modo da ottenere la massima sensibilità possibile. Il range di lunghezze d’onda del rivelatore DAD è stato modificato da 220-400nm a 200-300nm, visto che al di sopra dei 300 nm non ci sono adsorbimenti significativi da parte degli analiti. Il rilevatore UV invece è stato impostato in modo da registrare da 0 a 4.6min la lunghezza d’onda a 220nm, tempo necessario per l’eluizione dello stirene e del metil metacrilato, mentre da 4.6min fino a fine corsa la lunghezza d’onda a 247nm per la determinazione dell’anisolo. E’ stata poi testata la sensibilità del metodo eseguendo un’analisi del grezzo ad una concentrazione di circa 0,20 mg L-1. Il cromatogramma di quest’ultima analisi, da cui si nota il netto miglioramento della sensibilità rispetto al cromatogramma in Figura 42, è riportata in Figura 43.

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Figura 43: Cromatogramma del grezzo diluito in acetonitrile alla concentrazione di 0,20 mg/L. Fase mobile 70:30 (v/v) ACN:H2O. Cromatogramma estratto dal rivelatore DAD a 220nm. Il picco del metil metacrilato

mostra un tempo di ritenzione di 3,23 minuti, quello dell’anisolo di 4,13 minuti, mentre quello dello stirene è di 5,76 minuti.

Dopo aver ottenuto le condizioni che permettessero un adeguata separazione dei tre analiti, sono state effettuate delle analisi di alcuni campioni reali prelevati a tempi diversi durante la reazione di polimerizzazione. In Figura 44 si riporta il cromatogramma di un campione al tempo zero t 0, cioè nel momento in cui al grezzo è stato aggiunto l’iniziatore radicalico, alla concentrazione di 1,00 mg L-1. I campioni successivi, prelevati a tempi diversi durante la reazione, conterranno sempre più polimero che a causa dell’acqua presente nella fase mobile potrebbe precipitare in colonna. Si è quindi dovuto aggiungere al metodo uno step di lavaggio, che mediante un gradiente passa dalla fase in acetonitrile: acqua in 5 minuti al 100% in tetraidrofurano mantenuto per 5 min per poi tornare alle condizioni iniziali. Il tetraidrofurano risulta il miglior solvente per il polimero eventualmente presente in colonna.

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Figura 44 Cromatogramma del campione al tempo t0 di reazione diluito in ACN alla concentrazione di 1,00

mg/L. Fase mobile 70:30 (v/v) ACN:H2O con gradiente centrale in tetraidrofurano e rivelatori ottimizzati.

Cromatogramma estratto dal rivelatore DAD a 220nm. Il picco del metil metacrilato mostra un tempo di ritenzione di 3,20 minuti, quello dell’anisolo di 4,11 minuti, mentre quello dello stirene è di 5,71 minuti.

Si nota però che le prestazioni della colonna non sono più soddisfacenti, infatti le forme dei picchi non è più a gaussiana, per tale motivo è stata sostituita la colonna con una avente le stesse caratteristiche della precedente. Come si può notare dalla Figura 45, in cui si riporta il cromatogramma ottenuto con le condizioni ottimizzate e con la nuova colonna cromatografica, si ottengono picchi ben separati non allargati e i tempi di ritenzione concordano con quelli ottenuti dalla precedente colonna.

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Figura 45: Cromatogramma del grezzo diluito in acetonitrile alla concentrazione di 1,00 mg/L. Fase mobile 70:30 (v/v) ACN:H2O con gradiente centrale in tetraidrofurano e rivelatori ottimizzati. Nuova colonna.

Cromatogramma estratto dal rivelatore DAD a 220n). Il picco del metil metacrilato mostra un tempo di ritenzione di 3,25 minuti, quello dell’anisolo di 4,05 minuti, mentre quello dello stirene è di 5,57 minuti.