Analisi dei dat

Le rappresentazioni grafiche dei risultati degli esperimenti di binding (all’equilibrio che in cinetica) e degli esperimenti funzionali riportate in questo lavoro, sono ottenute con il programma GraphPad Prism vers. 5.02 (GraphPad Software, Inc. CA, USA). I valori sono espressi come media ± errore standard (± SEM) del numero n di esperimenti effettuati.

Nei dati ottenuti per gli esperimenti di binding all’equilibrio (curve di competizione omologa) è stato eliminato il binding aspecifico le curve sono calcolate un’analisi di regressione non lineare. I valori di Ki sono calcolati dai valori di IC50 [150]. In

particolare, per gli esperimenti di binding questo programma ci permette di ricavare per ogni curva dose-risposta i valori di IC50, cioè la concentrazione che inibisce del 50% il

binding specifico totale. La IC50 comunque non è equivalente alla Ki per il competitore,

perché questa dipende sia dalla concentrazione usata di radiolegante, sia dalla sua affinità nei confronti del recettore indagato e non rappresenta quindi un parametro “universale” di confronto per le molecole. Le curve per le cinetiche di dissociazione di [3H]-NMS sono calcolate come decadimento di tipo monoesponenziale. L’influenza sul rallentamento della cinetica di dissociazione di [3H]-NMS da parte dell’agente allosterico è espressa come percentuale della riduzione di [3H]-NMS. Le curve concentrazione-effetto per il rallentamento della cinetica di dissociazione di [3H]-NMS risultano da un’equazione logistica a 4 parametri. Il parametro “top” è il valore k-1 misurato in assenza del composto allosterico ed è fissato come 100%, mentre il punto di

flesso e la pendenza (dovuta a fattori n) sono settati come variabili. Il parametro “bottom” è considerato anch’esso una variabile, fornendo così un fit migliore se comparato con gli stessi dati ottenuti quando fissato come 0%. Infine sono stati testati anche i fattori di pendenza delle curve (F-test, P<0.05 valore di significanza statistica adottato). L’analisi dei dati per valutare l’effetto dei composti sul binding specifico del radioligando ortosterico [3H]-NMS è basato sul modello del complesso allosterico ternario (ATCM): l’equazione usata è quella di Lazareno & Birdsall [64]. Per quanto riguarda gli esperimenti per la misura della fosforilazione di ERK1/2, i valori ottenuti con il Flex Station 3 Microplate Reader (Molecolar Devices) sono relativi alle due lunghezze d'onda che abbiamo impostato per la lettura (620 nm e 655 nm) e da questi si calcola il rapporto delle due lunghezze d'onda moltiplicando il risultato per uno specifico fattore, secondo la seguente equazione:

Ratio = (segnale 665nm / segnale 620nm ) x 104.

Si ottiene così il valore di segnale relativo ad ogni molecola nelle condizioni (agonista o antagonista) saggiate. Al rapporto così ottenuto viene prima di tutto tolto il B (bianco) che rappresenta la lettura del campione alle lunghezze d’onda di riferimento in assenza di cellule. Dopo di che tutti i valori vengono normalizzati al valore ottenuto dall’aggiunta di Siero al 10% che rappresenta la produzione massimale di Erk. (100%).

5.1.11. Passive avoidance test

Il test è stato eseguito dal gruppo di ricerca della prof.ssa Ghelardini presso il Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica dell’Università di Firenze seguendo il protocollo sperimentale di Jarvik e Kopp [104], a cui sono state applicate alcune modifiche [103].

Viene preparata una scatola in acrilico costituita da due compartimenti, uno buio ed uno illuminato, separati da una parete attraversata da una porta a ghigliottina che permette l’entrata nella camera buia, ma non ne permette l’uscita. Dei due compartimenti uno resta buio. Il compartimento in questione è dotato di una botola, sotto cui viene sistemato, ad una distanza di 40 cm, un bagno di acqua fredda (circa 10°C).Nel compartimento illuminato viene collocato il topolino rivolto con il muso verso la parete esterna; l’animale per sua natura ricerca l’oscurità; nel momento in cui attraversa la porta ed entra nella zona buia, viene azionata una leva che spalanca la botola, così da far cadere nell’acqua il topolino. Questo, dopo pochi secondi, viene recuperato ed

5. Parte Sperimentale

asciugato, ma mantiene il ricordo dell’esperienza spiacevole.Il metodo originale prevedeva invece che l’animale subisse una scarica elettrica nel momento in cui entrava all’interno del compartimento non illuminato.I topolini che collocati nella camera illuminata, non entrano nella camera oscura nell’arco di tempo di 60 secondi, vengono scartati; generalmente per ogni gruppo di animali che si prepara, il 20-30% non viene utilizzato per questo motivo [103]. L’esperimento viene effettuato in due giorni consecutivi; il primo giorno (training session) il protocollo prevede la somministrazione di scopolamina (amnesizzante) al termine della sessione, iniettata per via i.p. Il giorno successivo (retention session) il test viene ripetuto.

Il giorno successivo dunque, il topolino è collocato nuovamente all’interno della scatola, nella camera illuminata; l’animale conserva il ricordo dell’esperienza sgradevole subita ed eviterà di entrare nel compartimento in ombra, trattenendosi alla luce per un intervallo di tempo maggiore.La differenza tra la latenza di entrata nella camera oscura del primo giorno e quella del secondo giorno è considerata un indice della capacità mnemonica del topo, ed è espressa in secondi (s).

Δ = (t’’ retention session – t’’ training session)

 Per valori alti di Δ si considera che il topolino ricordi la punizione subita.  Per valori bassi di Δ si considera che il topolino non abbia memoria

dell’esperienza.

Con questo test è possibile rivelare la capacità delle molecole in studio di proteggere gli animali dall’effetto amnesizzante della scopolamina: tale capacità è appunto propria dei farmaci nootropi. I farmaci in questione sono iniettati per via i.p. o p.o. 20 minuti prima dell’inizio della sessione sperimentale di training.Un farmaco è attivo come nootropo quando, ad una determinata dose, è capace di riportare la latenza di entrata dei topolini trattati con scopolamina, sui valori di quella dei topi del gruppo di controllo trattati con sola soluzione salina. Vengono classificate come inattive le sostanze che non manifestano alcuna attività alla dose massima di 10 mg/Kg. Attraverso questo test è possibile anche riconoscere se le sostanze oggetto di studio sono dotate di eventuali proprietà amnesizzanti; in tal caso gli animali trattati con queste molecole, ma non con scopolamina, mostrano una latenza d’entrata nella camera oscura paragonabile al valore esibito dagli animali trattati con scopolamina, ed esercitano effetto amnesizzante additivo se somministrate insieme alla scopolamina. Esempio di sessione sperimentale con valori medi di Δ raccolti su un numero di esperimenti compresi tra 9 e 22; ogni esperimento prevede l’utilizzo di quattro gruppi di circa 10 animali.

 il gruppo A, (10 topolini) di controllo, è trattato con soluzione salina: Δexp = 54.8’’

 il gruppo B (10 topolini) è trattato con soluzione salina e 1.5 mg/Kg di sostanza amnesizzante (scopolamina), iniettata i.p., 30’ dopo la punizione subita alla fine della training session. Δexp = 26.8”

 al gruppo C (10 topolini) viene inoculata la sostanza in studio (DM235) 20’ prima dell’inizio della training session per valutare l’effetto nootropo del farmaco, ovvero la capacità di proteggere l’animale dall’effetto amnesizzante della scopolamina inoculata alla fine della training session. Δexp = 71.0” per 0.001 mg /Kg i.p.

 sul gruppo D (10 topolini) si può testare la capacità della sostanza (DM235) di aumentare il tempo di latenza di entrata nella camera oscura rispetto al gruppo A di controllo (trattato solamente con soluzione salina). Si può così valutare il potere procognitivo del farmaco che viene sempre inoculato 20’ prima dell’inizio del training session: Δ exp = 94.6” per 1.0 mg/Kg s.c.

Dopo 30’ dalla punizione, quindi alla fine della training session, ai topolini vengono iniettati i.p. 1.5 mg/ Kg di scopolamina.Alcuni prodotti valutati con questa metodica, ovvero in assenza di scopolamina, si sono rivelati amnesizzanti: Δexp (EM194) = 28.1’ per 1.0 mg/Kg s.c.