Analisi dei dat

L’analisi bioinformatica è uno step essenziale nella tecnologia Next Generation, ed avviene a più livelli. Si può procedere all’analisi della run di sequenziamento, attraverso il software proprietario GS Run Browser. Inizialmente si valuta il valore di raw wells, che rappresenta il numero di wells che hanno alloro interno una bead, e quello di key pass wells, che ci dice quante delle raw wells sono state riconosciute attraverso la key region

66 presente a livello dell’adattatore; sono indici di buona qualità un valore di raw wells pari a circa il 50% del numero di biglie caricate, ed un valore di key pass wells che sia circa il 90% delle raw wells. Altri parametri di qualità della run sono la percentuale di passed filter wells, ovvero la percentuale di letture che hanno passato tutti i filtri, la quale deve essere maggiore del 50% , ed il valore di mixed + dots key pass, che esprime il numero di letture scartate per bassa qualità che deve essere inferiore al 25% . Da questa prima analisi si ottiene anche indicazione sulla lunghezza media, in bp, delle letture, ed è possibile visualizzare il segnale emesso dalla PTP ed anche il flowgram di ogni singolo pozzetto (Figura 11). L’efficienza del processo di target capture viene valutata tramite il mapping delle reads ottenute sul target. Le sequenze che mappano sul target vengono definite “in target”, mentre quelle che non mappano su questo “off target”. Con un esperimento ottimale si ottengono valori prossimi all’ 80% in termini di reads “in target”. Per ogni campione è stato valutato il numero totale di letture, il numero totale di basi lette, la lunghezza media dei frammenti e la profondità media del sequenziamento. Dopo aver valutato la qualità della corsa di sequenziamento, si procede con l’analisi dei file SFF. In particolare, avendo lavorato su due regioni 70X75mmsi ottengono due file SFF corrispondenti alle singole regioni. I file SFF vengono demultiplexati utilizzando il comando sfffile -s per ritrovare le sequenze relative ai singoli pazienti di cui è stata sequenziata la library. Questa fase è possibile grazie all’utilizzo dei MIDs utilizzati come barcode per la creazione delle libraries paziente-specifiche. I file che vengono ottenuti dopo il de multiplexing possono essere correlati al paziente in quanto presentano un prefisso relativo all’adattatore MID utilizzato (ex. RL10.454.sff) ma non presentano più gli adattatori, la sequenza MID e la key specifica della rapid library in quanto queste sequenze vengono riconosciute da sfffile e sottoposte a trimming. L’allineamento e il call delle varianti presenti in ogni singolo file SFF demultiplexato, avviene grazie al tool GS Reference Mapper (GS Mapper) che altro non è che un’interfaccia GUI (Graphic User Interface) dell’algoritmo newbler sviluppato da Roche. I parametri passati in ingresso al GS Mapper sono divisi in diverse sezioni e in particolare:

67 a) per la sezione Project:

1. References: tutti i cromosomi in formato FASTA relativi all’assembly Hg19 (GCHr37)

2. GS reads: il file SFF con le sequenze relative al paziente da analizzare (ex. RL10.454.sff)

b) per la sezione Parameters-Input:

1. Genome Annotation: il file RefGene relativo all’ assembly utilizzato (ex. Hg19)

2. Known SNPs: il file relativo alla build dbSNP con cui annotare gli SNP (ex. dbSNP131)

c) per la sezione Parameters-Computation: 1. parametri di default

c) per la sezione Parameters-Output:

1. Alignment Info: full output (il file 454AlignementInfo.tsv viene utilizzato in diversi script per l’analisi dati)

In breve, all’avvio dell’analisi il tool allinea le reads al genoma di riferimento (Hg19) e poi procede con il call delle varianti e con l’annotazione delle stesse utilizzando RefGene e dbSNP. Al termine dell’analisi, si ottengono in uscita le varianti ad alta confidenza (identificate in almeno due reads) che sono contenute all’interno del file 454HCDiffs.txt.

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Valutazione delle SNVs e delle INDELs. Per avere un’annotazione più accurata

delle varianti e per ottenere le frequenze alleliche relative alle varianti e anche le predizioni bioinformatiche sul potenziale impatto delle stesse, si procede con l’analisi del dato ottenuto con il software proprietario attraverso ANNOVAR (utilizzando l’interfaccia web wANNOVAR - http://wannovar.usc.edu/). Per far questo, il file 454HCDiffs.txt viene convertito nel formato ANNOVAR che richiede un formato |cromosoma| |start| |stop| |reference| |alternative|. Il risultato dell’elaborazione di ANNOVAR, viene filtrato utilizzando la localizzazione delle varianti e la relativa frequenze allelica. In particolare, vengono rimosse tutte le varianti localizzate negli introni e nel 5’ e 3’ UTR. Le varianti rimanenti (esoniche o nei siti canonici di splicing) vengono ulteriormente filtrate per frequenza allelica, eliminando tutte quelle che presentano una frequenza maggiore allo 0.01 (1%) in ESP6500-ALL (EA+AAL) o maggiore allo 0.01 (1%) in 1000g2012feb-ALL. ESP6500-ALL (EA+AAL) è un database che ha l’obbiettivo di scoprire nuovi geni e i meccanismi che contribuiscono a malattie del cuore, del polmone e del sangue tramite l’applicazione pionieristica delle tecniche di NGS nelle regioni codificanti proteine nel genoma umano. Condivide tutti i dati raccolti con l’intera comunità scientifica per aumentare ed estendere le possibilità di diagnosi delle malattie. ESP6500-ALL (EA+AAL) considerando i geni coinvolti nelle malattie del cuore, polmone e sangue per noi risulta molto utile come controllo per l’analisi dei geni coinvolti nell’epilessia. 1000g2012feb-ALL è un database che ha l’obbiettivo di trovare più varianti genetiche possibili con una frequenza minore del 1% nella popolazione studiata. È il primo progetto nato per sequenziare il genoma di un grande numero di persone, per fornire una risorsa completa delle varianti genetiche umane. Un riassunto sul flusso di filtraggio delle varianti effettuato da ANNOVAR è riportato nella figura 12.

69 Figura 12: Esempio di flusso di filtraggio delle varianti effettuato dal software ANNOVAR.

Valutazione migliorata dello splicing. Per avere una maggiore attenzione verso

le potenziali varianti di splicing, utilizziamo uno script PERL sviluppato in house, capace di analizzare varianti di splicing localizzate entro una distanza n dal sito canonico di splicing. Lo script utilizza il file 454AlignmentInfo.tsv e il file RefGene per incrociare le coordinate dei geni e in particolare degli start e stop esonici con la posizione delle varianti identificate. Impostando quindi un parametro n pari a 15, vengono evidenziate tutte le varianti comprese tra -15 e +15 dai siti canonici di splicing. Lo script è mostrato in figura 13.

70 Figura 13: Esempio di script PERL utilizzato per analizzare le varianti di splicing.

Valutazione del coverage nelle regioni target. Il processo di cattura e di

sequenziamento è abbastanza omogeneo ma presenta una variabilità intrinseca legata alle molte variabili presenti nella fase di cattura delle regioni target e del relativo sequenziamento. Questa variabilità deve essere controllata e si riflette in variazioni delle profondità di lettura del target. Abbiamo quindi la necessità di verificare come è stato sequenziato ogni singolo paziente e per far questo abbiamo sviluppato in house uno script PERL. I parametri passati allo script includono le coordinate del nostro target in formato GFF, la profondità minima accetta (per la quale il target viene considerato coperto dal sequenziamento) e il file 454AlignmentInfo.tsv. Lo script genera una serie di file tra cui il file uncovered.cov che contiene l’elenco delle posizioni cromosomiche, il nome del gene, e i relativi esoni che non hanno raggiunto il coverage minimo desiderato. Un esempio del file uncoverd.cov è riportato in figura 14. Queste regioni non catturate o

71 scarsamente sequenziate possono essere integrate mediante sequenziamento canonico di tipo Sanger qualora il clinico ritenga opportuna l’integrazione in quanto il fenotipo osservato ne suggeriva la necessità.

Figura 13: Esempio del file uncoverd.cov.