CELLULARI IN TIME-COURSE
Gli effetti dei trattamenti sono stati valutati considerando i seguenti parametri misurati a giorni alterni su una time-course di 14 giorni: numero di cellule, vitalità cellulare, pH, peso fresco, peso secco, tempo medio di duplicazione della biomassa (TMD). Sui campioni al quarto giorno di coltura è stata saggiata la produzione di H2O2. Tutte le analisi sono state eseguite in triplicato.
In una fase successiva è stato quantificato tramite HPLC il contenuto di resveratrolo e di altri stilbeni e flavonoidi in ogni campione di cellule e di terreno raccolto e conservati a –80°C. Nei campioni di cellule sono stati misurati anche gli antociani totali.
3.1 Conteggio del numero di cellule
Allo scopo di misurare la quantità di biomassa prodotta è stata utilizzata una camera di conta Nageotte. Essa ha una griglia suddivisa in 2 camere uguali, ognuna delle quali ripartita in 2 emicamere formate da 20 righe. Dopo aver caricato la sospensione cellulare adeguatamente diluita in una camera, si sono contate le cellule contenute in 10 righe non consecutive. La loro somma è stata moltiplicata per 80 (fattore della camera) e per il fattore di diluizione, in modo da ottenere la concentrazione di cellule per mL della sospensione di partenza.
3.2 Saggio della vitalità cellulare
Per il saggio di vitalità è stato utilizzato un colorante fluorescente, il diacetato di fluoresceina (Sigma), che marca specificatamente le cellule vive (Darzynkiewicz et al., 1994). E’, infatti, in grado di superare parete cellulare e plasmalemma localizzandosi nel citoplasma, dove entrano in azione le diacetilasi citosoliche che liberano la floresceina, il fluorocromo fluorescente che non è più in grado di diffondere fuori dalla cellula. L’azione delle diacetilasi è quasi istantanea, in questo modo, entro un paio di minuti, appaiono colorati solo i citoplasmi delle cellule vive, in quanto il diacetato rimasto nel mezzo di coltura o penetrato in cellule morte non è scisso e quindi il fluorocromo non emette fluorescenza.
Il colorante è stato preparato sciogliendo il diacetato di fluoresceina in acetone alla concentrazione di 1 mg/mL. Questa soluzione madre è stata diluita 1:10 in acqua deionizzata al momento dell’utilizzo.
L’analisi è stata effettuata posizionando una piccola aliquota di sospensione cellulare su di un vetrino portaoggetti per microscopia e colorandola con un pari volume di diacetato di fluoresceina 0,1 mg/mL. Dopo circa 1 minuto la preparazione è stata osservata ad un microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse E600 con lampada al mercurio, usando un filtro specifico per il colorante (B-2A: EX 450-490, DM 505, BA 520). In questo modo le cellule vive appaiono colorate di verde.
Il valore di vitalità cellulare è stato espresso come percentuale stimata di cellule vive sul totale osservabile in luce polarizzata.
3.3 Misurazione del pH della coltura
Il pH della coltura è stato misurato con un pHmetro Beckman Φ340 pH/Temp Meter.
Il valore del pH del terreno è indicativo delle condizioni della coltura. Bassi valori di pH indicano, infatti, una acidificazione del mezzo e quindi una situazione di stress dovuta alla tossicità dell’elicitore o ad inquinamenti. In questi casi, infatti, le cellule reagiscono rilasciando protoni, sintomo di lisi cellulare in corso.
3.4 Misurazione del peso cellulare e calcolo del TMD
La sospensione cellulare è stata filtrata su filtro di nylon con cut off 70 µm. Le cellule sono state pesate (FW, fresh weight) su di una bilancia di precisione e poi conservate a -80°C. Del terreno filtrato è stato misurato il volume e quindi lo si è conservato anch’esso a -20°C.
Entrambi i tipi di campioni sono stati utilizzati successivamente per la determinazione del contenuto di resveratrolo tramite analisi HPLC.
Coi dati del peso fresco delle cellule si è potuto calcolare il tempo medio di duplicazione della biomassa (TMD), un parametro indicativo del tasso di crescita della coltura. Si è utilizzata la seguente formula: ⋅ = 0 ln 2 ln FW FW t TMD e
dove “FWe” corrisponde al peso fresco medio misurato al termine della coltura, “FW0” al peso fresco iniziale, t alla durata in giorni di un ciclo di coltura (14 giorni).
Il peso secco è stato misurato ponendo in stufa a 80°C un campione pesato di cellule di ogni giorno di time course e misurando il peso dopo 48 ore. Si è poi calcolato il valore medio in termini di percentuale di peso fresco.
3.5 Controllo della presenza di H2O2
L’accumulo di acqua ossigenata all’interno delle cellule è sintomo di stress ossidativo. La sua eventuale presenza è stata controllata in campioni di cellule controllo e trattate con chitosano al quarto giorno di coltura, tramite un saggio colorimetrico modificato da quello descritto da Iriti et al. (2003).
Una aliquota di coltura cellulare è stata incubata per 4 ore al buio in presenza di 1 mg/mL di 3,3’-diaminobenzidina (DAB) in 0,1 N HCl, pH 5,6 (aggiustato con NaOH). In questo modo l’acqua ossigenata assume una colorazione rossiccia-marrone e l’osservazione al microscopio ottico ne rivela la presenza all’interno delle cellule.
3.6 Quantificazione di saccarosio e glucosio
I campioni di cellule (0,5 g) omogenate meccanicamente in un tampone Tris 100 mM HCl a pH 7.5 e quelli di terreno filtrato (1 mL) durante la time-course sono stati incubati per un’ora in un bagno a 60°C allo scopo di facilitare la solubilizzazione degli zuccheri. In seguito sono stati centrifugati a 15000g per 10 minuti ed il surnatante è stato utilizzato per la determinazione della concentrazione di saccarosio e glucosio tramite il “Sucrose Assay Kit”
glucosio-6-fosfato a 6-fosfogluconato. Quest’ultima reazione richiede la presenza di NAD+ che viene ridotto a NADH in quantità equimolare causando un incremento di assorbanza a 340 nm, direttamente proporzionale alla concentrazione di saccarosio. Per quantificare il glucosio è sufficiente omettere l’enzima invertasi.
Sono necessari 2 bianchi uguali per tutte le analisi: il bianco relativo dell’invertasi preparato con 100 µl di Sucrose Assay Reagent (bianco SAR) e 100 µl di acqua e quello relativo agli altri enzimi con 200 µl di acqua (bianco GAR). I campioni sono stati diluiti ad una concentrazione di zucchero compresa tra 100 e 1000 µg saccarosio/ml e per ognuno è stato preparato un bianco con 100 µl di campione e 100 µl di acqua. I campioni veri e propri sono stati miscelati 1:1 con 100 µl di SAR. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente sono stati aggiunti 1,8 ml di Glucose Assay Reagent (GAR). Dopo altri 15 minuti a temperatura ambiente sono state eseguite le letture allo spettrofotometro misurando l’assorbanza a 340 nm.
La concentrazione di saccarosio in mg/ml è stata calcolata tramite una formula fornita con il kit:
Abianco tot = (Abianco campione – AbiancoGAR) + AbiancoSAR ∆A = Acampione – Abianco tot
mg/ml di saccarosio = (∆A) (VT) (PM saccarosio) (F) A = assorbanza a 340 nm
VT = volume totale = 2,0 ml
PM saccarosio = peso molecolare del saccarosio = 342,30 Da F = fattore di diluizione
ε = coeff. di estinzione molare per NADH a 340 nm = 6,22 (ml/µmoli)(1/cm) d = cammino ottico = 1 cm
VC = volume del campione = 0,1 ml
Per la quantificazione del glucosio la formula è stata così modificata: ∆A = A bianco campione - A bianco glucosio
mg/ml di glucosio = (∆A) (VT) (PM glucosio) (F)
PM glucosio = peso molecolare del glucosio = 180,16 Da (ε) (d) (VC) 1000