Analisi di F.I.S.H (Ibridazione in situ fluorescente)

Sono state utilizzate le seguenti sonde commerciali:

 Sonde WCP Vysis e/o Starlab: sonde costituite da DNA genomico relativo a interi cromosomi;

 Sonda CEP Vysis e/o Aquarius Celbio: sonde relative al DNA alfoide dei cromosomi;

 Sonde ToTel Vision Kit Vysis: sonde locus specifiche relative alle regioni telomeriche

 Sonde LSI Vysis e/o Aquarius Celbio: sonde locus specifiche per diverse regioni cromosomiche.

E inoltre le sonde BAC/PAC gentilmente fornite dal prof. M.Rocchi dell’università di Bari (DI.GE.MI).

Preparazione delle sonde da cloni BAC / PAC

Colture batteriche

Per la crescita dei batteri è stato utilizzato terreno LB autoclavato contenente bactotryptone, estratto di lievito, NaCl, (bacto)agar per la preparazione delle piastre, cloramphenicolo (12,5 µg/l) o kanamicina (25µg/ml).

Le colture sono state fatte crescere per circa 16 ore a 37°C in continua agitazione.

Estrazione del DNA da colture batteriche

È stato utilizzato il metodo con fenolo-cloroformio (Sambrook, Fritsh e Maniatis, 1989) con le modifiche suggerite dai protocolli del Sanger Centre.

La metodica può essere così schematizzata:

- dopo circa 16 h di crescita la coltura è centrifugata a 4000 rpm per 10’ e al pellet ottenuto viene aggiunto un buffer di lisi (glucosio 50 mM, EDTA 10 mM, TRIS 25 mM pH 8,0), suddiviso in eppendorf ed incubato per 10’ a temperatura ambiente;

- si aggiunge a ciascuna eppendorf NaOH 0,2 M + SDS all’1%, si mescola gentilmente e si lascia in ghiaccio per 5’;

- viene aggiunto Na Acetato 3 M a pH 5,2, si mescola delicatamente per inversione e si lascia incubare in ghiaccio per 10’;

- dopo centrifugazione a 13000 rpm per 5’, si trasferisce il surnatante in nuovi tubi eppendorf e si lascia in ghiaccio per 10’;

- il DNA viene precipitato con isopropanolo, si mescola gentilmente e si lascia incubare per 30-45’ a temperatura ambiente;

- dopo centrifugazione a 13000 rpm per 5’, si rimuove il surnatante e il pellet così ottenuto viene sospeso in Na Acetato 0,3 M a pH 7,0; - si lascia in ghiaccio per 20-30’, si aggiunge fenolo/cloroformio (1:1)

e si mescola bene;

- dopo centrifugazione a 13000 rpm per 3’ si trasferisce la fase acquosa in un nuovo tubo eppendorf;

- al tubo eppendorf di partenza viene aggiunto Na Acetato 0,3 M pH 7,0 e si agita al vortex;

- dopo centrifugazione a 13000 rpm per 2’ si preleva un’altra piccola quota di fase acquosa e si aggiunge alla precedente;

- al totale della fase acquosa viene aggiunto isopropanolo, si mescola per rotazione e si incuba per 30’ a temperatura ambiente;

- dopo centrifugazione a 13000 rpm per 5’, al pellet viene aggiunto alcool etilico al 70% freddo. Si centrifuga a 13000 rpm per 20’ e si rimuove il surnatante;

- il pellet ottenuto, asciugato a 37°C per 30’, viene sciolto in opportuno volume di TE (10:1), al quale viene aggiunta RNAsi alla concentrazione finale di 200 µg/ml;

- dopo incubazione a 55°C per 15’ ( in alternativa a 37°C per 1-2 h) il campione viene quantificato mediante corsa elettroforetica in gel di agarosio allo 0,8% e quindi conservato a –20°C fino al momento dell’uso.

Marcatura delle sonde

Le sonde sono state marcate con Biotina-16-dUTP ( Biotin-16-2’-deoxy- uridine-5’-triphosphate) o con Digoxi-11-dUTP (Digoxigenin-11-2’-deoxy- uridine-5’ triphosphate). Per marcare le sonde abbiamo utilizzato la tecnica “nick traslation”. Il principio della reazione è il seguente: una molecola di DNA a doppio filamento viene digerito parzialmente con l’enzima DNAsi che taglia i legami fosfodiesterici tra due nucleotidi in posizioni casuali, lasciando delle interruzioni (“nicks”) su entrambi i filamenti. Interviene quindi un secondo enzima: la DNA polimerasi Ia che possiede attività sia esonucleasica che endonucleasica in direzione 5’-3’. La DNA polimerasi si lega in corrispondenza dei “nicks”, rimuove i nucleotidi grazie alla sua attività DNAsica e nello stesso tempo inizia la neo-sintesi di DNA, sostituendo la porzione di DNA rimossa con nuovi nucleotidi. Ciò avviene in opportune condizioni ed in presenza di nucleotidi trifosfati in soluzione; la timidina è parzialmente sostituita da Biotin-16 -dUTP o da Digoxigenin- 11-dUTP. Sia la biotina che la digoxigenina fungono da apteni, rilevabili

dopo ibridazione con anticorpi coniugati con un fluorocromo ( nel nostro caso Avidina-Texas Red per le sonde marcate con biotina e Antidigoxigenina Fluorescinata per quelle marcate con digoxigenina). Dopo la marcatura il DNA viene precipitato con DNA umano a Cot-1, DNA di sperma di salmone, Na Acetato 0,3 M e 3 volumi di alcool etilico 96% freddo (a –20°C), lasciato a –80°C per 15’ e centrifugato a 14000 rpm per 15’ a 4°C.

Il pellet viene lavato in alcool etilico al 70%, quindi fatto asciugare a 37°C per 30’e sciolto in un volume opportuno di mix di ibridazione costituito da formamide al 50% in 2X SSC e destran solfato al 10%.

Pretrattamento dei vetrini: i vetrini vecchi di 1-3 giorni, oppure invecchiati in stufa a 60°C per 2 h, sono stati trattati mediante passaggio in SSC 2X per 15’ a temperatura ambiente e poi disidratati attraverso una serie ascendente di alcoli (da alcool etilico al 50% ad alcool etilico assoluto), quindi fatti asciugare all’aria ed usati immediatamente.

Allestimento della F.I.S.H.: sui vetrini sono stati caricati 5 µl di sonda in corrispondenza dell’area sulla quale è stata depositata la sospensione cellulare; la goccia è stata ricoperta con vetrino “coprioggetto” di vetro 24x24 mm e fatta espandere premendo delicatamente, quindi chiusa con Rubber cement; l’ibridazione è avvenuta mediante co-denaturazione a 75°C per 5’e successiva incubazione a 37°C overnight, in ambiente umido, nell’apposito dispositivo Hybrite.

Lavaggi post ibridazione: dopo incubazione overnight il vetrino è stato smontato, quindi incubato per 2’ a 72°C in una soluzione costituita da SSC 0,4X addizionato di Nonidet allo 0,3%; è stato quindi eseguito un lavaggio rapido in SSC 2X addizionato di Nonidet allo 0,1% a temperatura ambiente, seguito da:

 lavaggio rapido in PBS 1X;

 colorazione in DAPI (200ng/ml) per 7’ in camera umida a temperatura ambiente;

 lavaggio rapido in PBS;

 lavaggio rapido in H20 distillata;

 montaggio del vetrino asciugato all’aria nell’apposito Mounting [DABCO (1,4-diazabicyclo-(2,2,2)octane, Sigma) al 2,33% in glicerolo al 90%].

Per le sonde marcate in Biotina o Digoxigenina:

rilevamento Cy3 dopo incubazione overnight il vetrino è stato smontato, quindi incubato per 2’ a 72°C in una soluzione costituita da SSC 0,4X addizionato di Nonidet allo 0,3%; è stato quindi eseguito un lavaggio rapido in SSC 2X addizionato di Nonidet allo 0,1% a temperatura ambiente, seguito da:

 lavaggio rapido in PBS 1X;

 Soluzione A per 5’ a t.a. in agitazione  Incubazione con Cy3 per 45’ a 37°  Soluzione A per 5’ a t.a. in agitazione  lavaggio rapido in PBS 1X;

 lavaggio rapido in H20 distillata

 colorazione in DAPI (200ng/ml) per 7’ in camera umida a temperatura ambiente;

 montaggio del vetrino asciugato all’aria nell’apposito Mounting [DABCO (1,4-diazabicyclo-(2,2,2)octane, Sigma) al 2,33% in glicerolo al 90%].

I vetrini così preparati sono pronti per l’osservazione al microscopio Olympus BX61 con filtri opportuni per il rilevamento della sonda.