7-Dataset utilizzato
8- Acquisizione ed analisi dat
8.2. Analisi di laboratorio
Il metodo spettrofotometrico insieme a quello fluorimetrico rappresentano due metodi affidabili anche quando si hanno tempi limitati e si voglio acquisire dati in continuo rispetto ad altre procedure analitiche come HPLC (Robinson, 1979) che invece prevedono tempi e costi molto più elevati. L'utilizzo del metodo del dosaggio dei pigmenti fotosintetici è inoltre essenziale dal momento in cui le misure della biomassa algale stanno venendo sempre più sostituite da misure automatiche (metodo fluorimetrico) o remote al fine di ricondurre tali misure nel range di valori reali. Questo metodo è stato utilizzato per calibrare le misure di fluorescenza acquisite con la sonda Primprod1.08 ed il fluorimetro del CTD.
In due campagne sono stati inoltre prelevati dei campioni sui quali misurare i parametri fotosintetici della curva PE tramite l'utilizzo del fluorimetro a fluorescenza variabile modulata WaterPAM, basato sempre sul metodo pump-and-probe utilizzato nelle condizioni controllate di laboratorio.
8.2.1. Estrazione e quantificazione dei pigmenti fotosintetici
Il numero di campioni d'acqua da prelevare vengono scelti durante la messa a punto del piano di campionamento e verificati durante l'acquisizione dei dati. Le quote alle quali prelevare il campione vengono infatti scelte sulla base del profilo di fluorescenza che viene acquisito mediante il fluorimetro. E' infatti essenziale prelevare i campioni ad un numero sufficiente di quote che siano rappresentative della distribuzione di biomassa lungo la colonna d'acqua. La quantità di acqua da
prelevare dipende dalle caratteristiche trofiche delle acque che si stanno studiando, in generale possono essere sufficienti 1-2L per analisi da effettuare in acque costiere mentre è necessario prelevare fino a 5L di campione in acque oligotrofiche di mare aperto. I campioni prelevati con la bottiglia Niskin devono essere prefiltrati tramite un retino di maglia di 250μm, per trattenere lo zooplancton ed frammenti di macroalghe (Strickland e Parson 1968; Lenz e Fritsche, 1980) e conservati al fresco in bottiglie nere al fine di evitare che il processo fotosintetico vada avanti inficiando la misura di concentrazione di fitoplancton.
La fase successiva consiste del filtrare l'acqua attraverso un filtro in fibra di vetro Whatman GF/F apponendo una differenza di pressione ai due lati del filtro tramite l'utilizzo di una pompa da vuoto, al fine di velocizzare il processo. La depressione applicata deve comunque essere bassa in modo da non rovinare le cellule ne tanto meno lacerare il filtro. Una volta filtrata tutta l'acqua del campione, sul filtro sarà stato concentrato tutto il fitoplancton che vi era in sospensione. Il filtro, una volta prosciugato, viene conservato in 5mL di acetone ppa [(CH3)2CO] al 90% o al 100% a
seconda che l'analisi sia effettuata immediatamente o che il filtro debba essere conservato.
Il processo di conservazione è molto delicato poiché si innescano con facilità processi di degradazione che potrebbero portare alla sottostima della concentrazione della biomassa (Rai e Marker, 1982), è quindi preferibile sempre effettuare le misure subito dopo il campionamento. Il filtro deve essere triturato ed omogeneizzato per un massimo di 2 minuti con un pestello di vetro aggiungendo 5mL di acetone all'80%, se il filtro è stato conservato in acetone puro al fine di ottenere una concentrazione finale di 90%. La provetta contenente il filtro triturato e l'acetone viene quindi mantenuta per 24h a 4°C per facilitare l'estrazione. Dopo le 24 ore le provette vengono centrifugate per 10 minuti a 4000 rpm (o 3500 per 12 minuti se non refrigerate). Dopo la centrifugazione viene recuperato il sovranatante con una pipetta e posto all'interno di una cuvetta da utilizzare per le misure con lo spettrofotometro.
assumendo che il rapporto tra i loro coefficienti di assorbimento specifico sia uguale a quello tra clorofilla-a e feofitina-a. Vengono selezionate le lunghezze d'onda di interesse alle quali viene misurato il valore di assorbanza. La procedura analitica prevede l'aggiunta di 50mm³ per ogni 5mL di estratto e la ripetizione delle misurazioni a 665 e 750nm dopo 30-60sec, per far in modo che tutta la clorofilla-a venga convertita in feofitina.
Viene quindi misurata l'assorbanza prima e dopo l'acidificazione secondo la seguente formula:
(665 ) [ ( ,665 )
( ,665 )] [ ( ,750 )
( , 750 )]
A
a
=
A s
a
-A b
a
-
A s
a
-A b
a
(8.2.1.-1)
dove:
A(b,665) = densità ottica del bianco a 665nm; A(b,750) = assorbanza del bianco a 750nm;
A(s,665α) = densità ottica del campione a 665nm prima (α=0) o dopo acidificazione (α=a); A(s,750α) = densità ottica del campione a 750nm prima (α=0) o dopo acidificazione (α=a). La concentrazione di clorofilla-a e di feopigmenti si calcolano applicando le seguenti formule:
3
(
/
) 26.73 [ (665 )
(665 )]
10³ / (
)
Chl a mg m-
=
×
A
o
-A
a
× ×v
co V×
(8.2.1.-2) 3(
/
) 26.73 [1.7
(665 )
(665 )]
10³ / (
)
Feopigmenti mg m
=
×
×A
a
-A
o v× ×
co V×
(8.2.1.-3) dove:A(665o)= densità ottica netta del campione a 665 nm prima dell'acidificazione; A(665a)= densità ottica netta del campione a 665 nm dopo l'acidificazione; co = cammino ottico della celletta (cm);
v = volume dell'estratto (mL);
8.2.2. Misura dei parametri fotosintetici
Le curve PE da cui estrarre i parametri fotosintetici sono state misurate in situ con il fluorimetro a fluorescenza variabile modulata WATER-PAM (Walz), questo fluorimetro è adatto a qualsiasi luce ambientale (Lazzara et al. 2010) ed è specifico per concentrazioni microalgali basse come tipico delle acque oligotrofiche (sensibilità fino a 0.1 mg Chl-a L-1).
Fig.8.2.2.-1: Fluorimetro a fluorescenza variabile modulata WATER-PAM (Walz)
Il WATER-PAM, come anche la PrimProd1.08 è in grado di misurare la fluorescenza massima Fmax, quando il plastochinone è ridotto in tutti i centri di reazione e minima F0 quando è ossidata . Il
campione viene adattato al buio o ad una radiazione nel rosso lontano, tutti i centri di reazione si aprono ed una luce di bassa intensità (<1-2 μE m-2s-1), anche se non innesca il processo fotosintetico
(measuring light), determina l'emissione di fluorescenza minima F0. Successivamente viene inviato
un impulso saturante con una luce molto intensa (0.6-0.8 sec) e recuperata la fluorescenza massima Fmax Al buio la luce attinica costante determina l'aumento repentino della fluorescenza (Kautsky et
può essere emessa fluorescenza. L'invio di un impulso saturante fa quindi aumentare la fluorescenza fino al valore massimo di Fmax' per poi decadere fino a Ft. Le curve PE sono state misurate subito
dopo il campionamento su ognuna delle quattro repliche effettuate sui campioni prelevati. Ogni campione è stato pre-acclimatato al buio per tre minuti e successivamente sottoposto ad una serie di nove PAR con intensità crescente compresa nell'intervallo di 0 e 1400 μE m-2 s-1 circa. Le quattro
curve misurate per ciascun campione sono state successivamente interpolate secondo l’equazione di Platt et al. (1980) al fine di ottenere i parametri α, Pmax, β ed Ek .