rappresentazioni grafiche.
Una volta ottenute le intensit`a, sono stati “rimossi” i geni saturati e gli spot di controllo, assegnando loro peso 0.1. Infine, i valori sono stati normalizzati, sia tra array che all’interno degli stessi, utilizzando il metodo loess (che `e uno dei pi`u usati dai biologi). Le figg. 4.1, 4.2 e 4.3 rappresentano gli M A-plot normalizzati dei 6 slides.
4.3
L’analisi dell’espressione genica
A questo punto `e stato possibile stimare un modello lineare per ogni gene at- traverso la funzione lmFit. Considerando l’applicazione del dye-swap e rispettan- do l’ordine di caricamento dei file, la matrice del disegno X `e stata fissata a X = 1 −1 −1 1 1 −1 .
Ottenuti i modelli, sono state calcolate le statistiche B e gli iperparametri (e- scluso p) tramite la funzione eBayes, fissando la proporzione di geni differen- zialmente espressi p = 0.01. Le stime ricavate sono presentate nella tabella 4.1. Quella che sembra meno affidabile `e la stima del parametro v0, dato che
d0 = 1.5013
s2
0 = 0.0144
v0 = 37.9572
Tabella 4.1: Stime degli iperparametri con p = 0.01
70 CAPITOLO 4. UN’APPLICAZIONE A DATI REALI 0 5 10 15 −10 0 5
Primo array
A M 0 5 10 15 −10 0 5Secondo array
A M4.3. L’ANALISI DELL’ESPRESSIONE GENICA 71 0 5 10 15 −2 0 2 4
Terzo array
A M 0 5 10 15 −2 0 2 4Quarto array
A M72 CAPITOLO 4. UN’APPLICAZIONE A DATI REALI 0 5 10 15 −8 −4 0 4
Quinto array
A M 0 5 10 15 −4 −2 0 2Sesto array
A M4.3. L’ANALISI DELL’ESPRESSIONE GENICA 73 che LIMMA pone dei limiti alla stima della quantit`a qv0s20, e di conseguenza
i due parametri v0 e s20 sono in qualche modo legati. In fig. 4.4 `e rappresen-
tato l’istogramma dei valori di B ottenuti con questo modello, mentre la fig. 4.5 mostra il cosiddetto “vulcano plot”. Ci si aspetta che i valori pi`u grandi indichino geni differenzialmente espressi.
Istogramma dei valori B
B Frequency −5 0 5 0 100 200 300 400 500 600
Figura 4.4: Istogramma dei valori di B stimati con p = 0.01.
A conclusione dell’analisi, solitamente, si decide arbitrariamente quanti geni considerare differenzialmente espressi, prendendo ad esempio i primi 50, o i pri- mi 100 ordinati secondo il valore di B. La tabella 4.4 presenta le statistiche t, B e i valori-p dei primi 20 spot identificati da questo modello (i nomi dei geni sono di fantasia per garantire la riservatezza delle informazioni).
74 CAPITOLO 4. UN’APPLICAZIONE A DATI REALI −1.5 −1.0 −0.5 0.0 0.5 1.0 −6 −4 −2 0 2 4 6
Grafico delle medie di Y con le statistiche B
Medie dei valori Y
B
Figura 4.5: Grafico delle medie dei valori di Y con le statistiche B stimate (vulcano plot).
4.3. L’ANALISI DELL’ESPRESSIONE GENICA 75
Index Name t P.Value B 813 AAA2 17.0944 0.0013 6.2952 333 AAA1 16.7179 0.0013 6.2130 278 BBB1 -12.0713 0.0069 4.1649 1514 EEE1 11.2081 0.0073 3.7354 344 FFF1 11.0028 0.0073 3.6183 1610 CCC1 -10.5036 0.0078 3.2546 1698 DDD1 10.2866 0.0078 3.1178 753 MMM1 10.7733 0.0116 2.5294 758 BBB2 -9.1554 0.0116 2.4455 1484 HHH1 -9.1072 0.0116 2.4117 524 III1 8.8842 0.0116 2.2529 1419 GGG1 8.8522 0.0116 2.1316 1306 LLL1 -8.5475 0.0123 1.9524 1130 CCC2 -8.5878 0.0123 1.9331 526 TTT1 8.0833 0.0158 1.7093 1756 UUU1 7.7923 0.0158 1.5427 641 OOO1 7.8841 0.0158 1.4305 525 PPP1 7.8557 0.0158 1.4073 251 NNN1 -7.8725 0.0158 1.3664 1034 EEE2 7.5198 0.0161 1.1891
76 CAPITOLO 4. UN’APPLICAZIONE A DATI REALI Implementazione del metodo iterativo
Partendo dal valore p = 0.01 e applicando il metodo di Smyth, sono state effet- tuate 100 iterazioni sul modello per ottenere la stima del parametro: il valore raggiunto `e p = 0.3573, ossia il 35.73% degli spots analizzati risulta differen- zialmente espresso (per ottenere il numero di geni differenzialmente espressi `e sufficiente dividere questo risultato per due, essendo ogni gene considerato due volte negli array). In fig. 4.6 `e rappresentata la successione dei valori. Rispetto
0 20 40 60 80 100 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 Stime di p Iterazioni p
Figura 4.6: Grafico dei valori di p stimati nelle 100 iterazioni.
alle simulazioni effettuate nel capitolo precedente, e alle aspettative che si hanno a priori, il valore di p sembra elevato. Due sono le possibili spiegazioni:
• i geni differenzialmente espressi sono effettivamente il 35.73% del totale, che potrebbe essere ragionevole, dato che l’esperimento `e stato effettuato considerando geni selezionati in base a conoscenze precedenti;
4.3. L’ANALISI DELL’ESPRESSIONE GENICA 77 • il modello utilizzato per determinare p non riesce a spiegare questi dati, che non pu`o essere assolutamente escluso, data la peculiarit`a di questo tipo di esperimenti.
Con questa nuova proporzione p, gli altri iperparametri risultano (tabella 4.3):
d0 = 1.5013
s2
0 = 0.01442
v0 = 4.1979
Tabella 4.3: Stime degli iperparametri con p = 0.3573
Le stime dei parametri d0 ed s20 non sono cambiate, mentre v0 ha assunto un
valore pi`u ragionevole. Naturalmente, anche i valori di B vengono modificati; le figg. 4.7 e 4.8 rappresentano rispettivamente l’istogramma e il vulcano plot dei valori di B stimati con questo nuovo modello.
Istogramma dei nuovi valori B
B Frequency −2 0 2 4 6 8 0 100 200 300 400 500 600 700
78 CAPITOLO 4. UN’APPLICAZIONE A DATI REALI −1.5 −1.0 −0.5 0.0 0.5 1.0 −2 0 2 4 6 8
Grafico delle medie di Y con le nuove statistiche B
Medie dei valori Y
B
Figura 4.8: Grafico delle medie dei valori di Y con le nuove statistiche B stimate con p = 0.3573 (vulcano plot).
4.3. L’ANALISI DELL’ESPRESSIONE GENICA 79 Nella tabella 4.2, invece, sono riportati i primi 20 geni selezionati da questo sec- ondo modello: `e evidente che i valori delle statistiche sono diversi dai precedenti, ed anche l’ordinamento dei geni presenta delle piccole variazioni con il nuovo parametro p; si pu`o comunque presumere che siano dovute ad arrotondamenti. La maggior parte di essi, tuttavia, viene identificata in entrambi i modelli.
Index Name t P.Value B 333 AAA1 16.7179 0.0013 8.0336 813 AAA2 17.0944 0.0013 7.7027 278 BBB1 -12.0713 0.0068 7.2882 1610 CCC1 -10.5036 0.0079 6.7413 1698 DDD1 10.2869 0.0079 6.6545 1514 EEE1 11.2081 0.0073 6.5780 344 FFF1 11.0028 0.0073 6.5162 1419 GGG1 8.8522 0.0120 5.9960 1130 CCC2 -8.5878 0.0123 5.8567 758 BBB2 -9.1554 0.0117 5.8476 1484 HHH1 -9.1072 0.0117 5.8270 524 III1 8.8842 0.0117 5.7294 1306 LLL1 -8.5474 0.0123 5.7275 753 MMM1 10.7732 0.0117 5.5233 251 NNN1 -7.8725 0.0158 5.4471 641 OOO1 7.8841 0.0158 5.3666 525 PPP1 7.8557 0.0158 5.3501 1803 QQQ1 7.6388 0.0162 5.3021 1771 RRR1 7.5892 0.0162 5.2706 35 SSS1 7.5437 0.0162 5.2414
Capitolo 5
Conclusioni
Nel corso di questa tesi si `e cercato di comprendere le caratteristiche delle pro- cedure di stima del parametro p all’interno dell’analisi di esperimenti di mi- croarray, con particolare riferimento al modello bayesiano empirico sviluppato in L¨onnstedt & Speed (2002) e ripreso in Smyth (2004). Sono stati considerati due metodi di stima proposti in letteratura: uno da Smyth (2004) e uno da L¨onnstedt & Britton (2005).
Poich´e non esiste uno studio delle propriet`a formali di queste stime, in questa tesi si `e effettuato uno studio empirico di tali propriet`a, attraverso diverse simu- lazioni. Con riferimento ad un’esemplificazione del modello di Smyth (2004), `e stato costruito un grafo (fig. 2.2), sulla base del quale `e stato possibile simu- lare un ipotetico insieme di dati; si sono fissati arbitrariamente i quattro iper- parametri p, v0, d0 ed s20, e successivamente sono state generate le rimanenti
variabili. Si `e studiato il comportamento degli stimatori di p al variare di n, la numerosit`a campionaria, e G, il numero di geni, apprendendo non solo che `e utile all’analisi disporre di un gran numero di replicazioni per ogni gene, ma che anche il numero di geni stesso pu`o influire sulla bont`a delle stime dei parametri. Si `e visto che i due stimatori considerati si comportano in modo molto diverso tra loro: quello di L¨onnstedt & Britton ha prodotto stime molto distorte in tutte le simulazioni effettuate, mentre quello di Smyth ha rivelato buone capacit`a di stima. I risultati che sono stati ottenuti incoraggiano, quindi, l’uso dello
82 CAPITOLO 5. CONCLUSIONI stimatore di Smyth che, non solo `e nettamente superiore all’altro proposto in termini di distorsione, ma sembra essere anche molto efficiente.
`
E importante ricordare che i risultati sono stati raggiunti a partire da dati simulati, che, per costruzione, soddisfano gli assunti del modello. Per questo motivo, il passaggio ai dati reali non `e immediato, in particolare `e da attendersi che non tutte le assunzioni siano soddisfatte. Inoltre, riportandosi nei casi reali in cui spesso si dispone di scarsa informazione, ci si rende immediatamente conto di quanto poco si conosca questo tipo di dati. Per ottenerli, di fatto, occorrono diversi passaggi, ciascuno soggetto ad errori e a valutazioni soggettive; le scelte che si compiono, riguardo ad esempio all’analisi delle immagini o alle tecniche di normalizzazione, fanno parte esse stesse dell’esperimento ed in molti casi non si conosce l’effetto che abbiano sui dati. Nei modelli che si propongono diventa difficile quantificare tutte queste informazioni, e di conseguenza ottenere dati in qualche modo “depurati”.
Successivamente, si `e applicata la procedura di Smyth su dati provenienti da un esperimento reale, effettuato su linee cellulari e riguardante geni presumibil- mente coinvolti nel tumore al seno. Si `e ottenuta una stima della proporzione di geni differenzialmente espressi in qualche modo inattesa, in relazione all’ordine di grandezza; questo risultato ha sollevato alcuni dubbi sull’adattamento del modello utilizzato ai dati.
I metodi bayesiani e bayesiani empirici sembrano adeguati all’analisi di questi esperimenti. In particolare, la flessibilit`a che concedono pu`o essere molto importante per includere nei modelli le conoscenze a priori che si riescono a rac- cogliere, soprattutto per quel che riguarda la variabilit`a delle misurazioni. Pro- seguire su questa strada, quindi, potr`a portare a miglioramenti nella precisione delle analisi svolte.
Uno studio della robustezza del metodo di stima di Smyth potrebbe es- sere un naturale proseguimento di questo lavoro, poich´e arricchirebbe sicura- mente le conoscenze sia su questo parametro, ovvero la proporzione di geni differenzialmente espressi, sia, conseguentemente, sull’effettiva espressione dei geni analizzati.
Appendice A
Codice R utilizzato nelle
simulazioni
Simulazioni con un numero di geni costante seSM<-c() seLO<-c() seFD<-c() medieSM<-c() medieLO<-c() medieFD<-c() totfalsi<-c() totfalsi2<-c() totqualiSM<-c() totneg<-c() totpos<-c() slides<-c(5,10,15,20,50,100,150,200,300) L<-300 #numero di simulazioni
G<-1000 #numero di geni, fissato d0<-3
s2_0<-1 v0<-4
84 APPENDICE A. CODICE R UTILIZZATO NELLE SIMULAZIONI p<-0.03 #proporzione di geni diff. espressi
################################################################
for (n in slides){ qualiSM<-c()
lista<-c() #lista che conterr`a i valori di p stimati (Smyth) listap<-c()
listalonn<-c() #lista che conterr`a i valori di p stimati (L¨onnst.) listafdr<-c() #lista che conterr`a i valori di p stimati (fdr) par<-matrix(0,nrow=L,ncol=3,byrow=T) tot<-c() totSM<-c() listaazz<-c() fpos<-c() fneg<-c() for (j in 1:L){ cont<-0 m<-matrix(0,nrow=G,ncol=n,byrow=T)
quali<-c() #tiene memoria dei geni realmente diff. espressi for (i in 1:G) { sigma2<-rchisq(1,d0)/(s2_0*d0) sigma2<-1/sigma2 d<-rbinom(1,1,p) if (d==0) mu<-0 else { cont<-cont+1 quali<-c(quali,i) mu<-rnorm(1,0,sqrt(sigma2*v0)) }
85 y<-rnorm(n,mu,sqrt(sigma2))
m[i,]<-y }
tot<-c(tot,quali)
fitm<-lmFit(m) #stimo un modello lineare per ogni gene p2<-0.01
for (k in 1:15){ #ciclo per la determinazione di p (Smyth) #calcolo l’odds a posteriori per ogni gene (e i parametri) fit<-eBayes(fitm,proportion=p2)
listap<-c(listap,p2)
#calcolo p secondo il metodo iterativo di Smyth p2new<-sum(exp(fit$lods)/(1+exp(fit$lods)))/G if (k==15) break
p2<-p2new }
ord<-order(fit$lods,decreasing=T)
#indici dei geni che il metodo Smyth dichiara diff. espressi qualiSM<-ord[1:(p2*G)]
totSM<-c(totSM,qualiSM[order(qualiSM)])
###########ciclo per i falsi positivi e negativi#########
azz<-0
if (length(quali)==0){
if (length(qualiSM)==0) ("Nessun gene diff. espresso") else { fpos<-c(fpos,length(qualiSM)) fneg<-c(fneg,0)} } else { if (length(qualiSM)==0) {
86 APPENDICE A. CODICE R UTILIZZATO NELLE SIMULAZIONI fneg<-c(fneg,length(quali)) fpos<-c(fpos,0)} else{ for (i in 1:(length(qualiSM))){ mm=1 while (mm<=length(quali)){ if (qualiSM[i]==quali[mm]) { azz<-azz+1 break} else mm=mm+1 } } listaazz<-c(listaazz,azz) fneg<-c(fneg,(length(quali)-azz)) fpos<-c(fpos,(length(qualiSM)-azz)) } } ##################### lista<-c(lista,p2)
pfdr<-0 #calcolo p con la stat. t-moderata, aggiustando con fdr adj<-topTable(fit,number=G,adjust="fdr") for (w in 1:G){ if (adj$P.Value[w]<0.05) pfdr<-pfdr+1 } listafdr<-c(listafdr,pfdr/G) k1<-(n-3)/(n-1)*mean(m^2)-1/n k2<-((n-2)*sqrt(pi)*gamma((n-1)/2)*sqrt(n))/(2*sqrt(n-1)* gamma(n/2))* mean(abs(m))-1 plonn<-k2^2/(n*k1-2*k2) listalonn<-c(listalonn,plonn) }
87 medieSM<-c(medieSM,mean(lista)) medieLO<-c(medieLO,mean(listalonn)) medieFD<-c(medieFD,mean(listafdr)) seSM<-c(seSM,sqrt(var(lista))) seLO<-c(seLO,sqrt(var(listalonn))) seFD<-c(seFD,sqrt(var(listafdr))) totqualiSM<-c(totqualiSM,totSM) totfalsi<-c(totfalsi,mean((fpos+fneg)/G)) totfalsi2<-c(totfalsi2,mean((fpos+fneg)/length(quali))) totneg<-c(totneg,mean(fneg)) totpos<-c(totpos,mean(fpos)) }
Semplicemente sostituendo alla variabile slides la variabile geni, conte- nente i valori di G per i quali si vuole svolgere l’analisi, si ottiene il listato delle simulazioni effettuate con un numero di replicazioni costante (ossia n fissato).
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