Analisi di espressione mediante RT-PCR

La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica che consente di ricostruire in vitro uno specifico passaggio della duplicazione cellulare: la ricostruzione (sintesi) di un segmento di DNA a doppia elica a partire da un filamento a singola elica. Il filamento mancante viene ricostruito a partire da una serie di nucleotidi che vengono disposti nella corretta sequenza, complementare a quella del DNA interessato.

3.16.1 Estrazione di mRNA totale dalle cellule

L’estrazione di mRNA è stata effettuata tramite Trizol® Reagent (Sigma-Aldrich), una soluzione monobasica di fenolo e guanidina isotiocianato. Dopo 3 h dal trattamento, le cellule sono state tripsinizzate, centrifugate e lavate con PBS 1X. I pellet sono stati incubati in 1 mL di Trizol® Reagent per 5 min, a TA. In seguito all’aggiunta di una soluzione di cloroformio (0.2 mL) (Sigma-Aldrich), i campioni sono stati vortexati per 15 sec ed incubati per 3 min a TA. Dopo centrifugazione a 12000 g per 15 min a 4°C, la fase superiore acquosa, contenente l’RNA, è stata prelevata e trasferita in una eppendorf da 1.5 mL. Successivamente, è stata eseguita la precipitazione dell’acido nucleico RNA mediante l’aggiunta di 0.5 mL di soluzione di isopropanolo (Sigma-Aldrich) ed incubazione per 10 min a TA. I campioni sono stati poi centrifugati a 12000 g per 10 min a 4°C e i pellet lavati in 1 mL di soluzione di etanolo al 75% e nuovamente centrifugati a 7500 g per 5 min a 4°C. Dopo rimozione del surnatante ed evaporazione delle tracce di etanolo, i campioni di RNA sono stati risospesi nella soluzione acquosa DEPC (dietilpirocarbonato) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), contenente l’inibitore delle RNAse cellulari. I campioni sono stati trasferiti in eppendorf da 0.2 mL RNAse-free e conservati a –80°C.

3.16.2 Quantificazione spettrofotometrica di RNA

La quantificazione degli RNA estratti è stata effettuata con lo spettrofotometro NANODROP 2000 (Thermo Fisher Scientific). Utilizzando 1 μL di ciascun campione, è stata determinata l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 260 nm. In parallelo, l’identificazione dell’assorbanza a 280 e a 230 nm, corrispondenti, rispettivamente, alla lunghezza d’onda di assorbimento di proteine e carboidrati, ha consentito di valutare la purezza degli RNA. Per lo studio di espressione genica, sono stati impiegati solo i campioni per i quali il rapporto 260/280 è risultato superiore a 1.95.

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3.16.3 Retrotrascrizione dell’mRNA

Consente di ottenere un filamento di DNA complementare al filamento di mRNA che funge da stampo. Tale filamento di DNA è il DNA copia (cDNA) dell’mRNA e non copia del gene. Nella miscela di reazione sono presenti tutti gli mRNA che sono stati prodotti dalle cellule e poi estratti. Per ottenere i cDNA solo degli mRNA d’interesse vengono aggiunti all’ambiente di reazione dei primer che sono brevi sequenze di nucleotidi ottenute per sintesi e disegnate in modo da essere complementari solo al mRNA di interesse. Nella tabella sottostante sono riportate le sequenze dei primers utilizzati.

Marcatore Sigla Sequenza (5’-3’) ^{Sequenza di}

riferimento ^pb β-Actina ACTB F-TGACGTGGACATCCGCAAAG R-TGGAAGGTGGACAGCGAGG NM_001101 205 β-Catenina CTNNB1 F-CTTCACCTGACAGATCCAAGTC R-CCTTCCATCCCTTCCTGTTTAG NM_001904 98 Ciclina D1 CCND1 F- GCGGAGGAGAACAAACAGAT R- GAGGGCGGATTGGAAATGA NM_053056.2 92 C-myc MYC F- CTCCACACATCAGCACAACTA R- TGTCCAACTTGACCCTCTTG NM_002467 80 CD44v6 CD44R2 F- TCCAGGCAACTCCTA R- CAGCTGTCCCTGTTG NM_001202555.1 129

Coppie di primers utilizzate nello studio di RT-PCR F: Forward; R: Reverse.

I primer così costruiti si accoppiano selettivamente, secondo Watson e Crick, ai filamenti di mRNA complementari. L’ibrido mRNA-primer di DNA è l’innesco ideale per l’enzima virale Trascrittasi Inversa che da uno stampo di mRNA riesce a trascrivere un filamento copia di DNA.

3.16.4 Reazione di retrotrascrizione e PCR: reazione a catena della polimerasi I campioni di RNA sono stati retrotrascritti e amplificati tramite OneStep RT-PCR Kit (QUIAGEN, Hilden, GE) seguendo il protocollo della ditta. Ogni tubo di reazione era composto da: 5 µL di Buffer 5X, 5 µL di Qsolution 5X, 1 µL di dNTPs mix, 1.5 µL di

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primer Forward (10µM), 1.5 µL di primer Reverse (10µM), 1 µL di enzima, 1 µL di RNA (80 ng/µL) e 9 µL di Acqua. La reazione è stata eseguita utilizzando il termociclatore C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad) alle condizioni indicante nella tabella sottostante.

Fasi Tempo Temperatura

Retrotrascrizione 30 min 50 °C

Attivazione DNA polimerasi

15 min 95 °C

Denaturazione DNA 1 min 94 °C

Annealing 1 min 57 °C

Estensione 1 min 72 °C

Numero di cicli: 39

Estensione finale 10 min 72 °C

3.16.5 Elettroforesi su gel di agarosio

L’analisi elettroforetica dei prodotti di reazione PCR è stata eseguita su gel di agarosio (Sigma-Aldrich) preparato al 3% in soluzione tampone TBE 1X (0.04 mM tris-Borato, 0.001 M EDTA, pH 8) (Sigma-Aldrich) e Gel Red (0.1 μL/mL) (Biotium). La soluzione è stata versata in una vaschetta per elettroforesi avente già fissati i pettini. Questi pettini formano nel gel dei pozzetti dove viene introdotto il campione da analizzare. L’EDTA del tampone serve ad impedire alle nucleasi eventualmente presenti di agire distruggendo il campione, perché chela gli ioni Mg2+ indispensabili al funzionamento delle nucleasi. L’agarosio ha la proprietà di formare spontaneamente reticoli 3D: maggiore è la concentrazione di agarosio, più piccole saranno le maglie del gel che si otterranno. Il gel di agarosio funge quindi da setaccio molecolare per separare gli acidi nucleici in base al loro raggio idrodinamico, che è direttamente proporzionale al PM: se non ci fosse il reticolo 3D, tutti i diversi frammenti di acido nucleico elettromigrerebbero allo stesso modo senza poter essere separati. Per ciascun campione, sono stati caricati su gel 8 μL di prodotto di amplificazione e 2 μL di soluzione colorante Gel Loading Buffer (Sigma-Aldrich). In parallelo, è stato caricato il PCR Marker (Thermo Fisher Scientific), un marcatore di riferimento di peso molecolare compreso tra 25 e 700 pb. La corsa elettroforetica è stata eseguita

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applicando una differenza di potenziale al sistema di 80 Volt: il polianione elettromigrava nel gel di agarosio lungo le linee di campo elettrico dal polo negativo verso il polo positivo. Alla fine della corsa le bande dei prodotti di amplificazione sono state visualizzate tramite transilluminatore UV Gel Doc 2000 Gel Documentation System (Bio-Rad). L’analisi quantitativa delle bande è stata eseguita con il software ImageLab 5.2.1 (Bio-Rad) e la normalizzazione dei marcatori di interesse è stata effettuata verso la -actina.