Analisi della frazione volatile dei vin

La frazione volatile dei campioni di vino base utilizzato per il marsala è stata analizzata mediante gascromatografia con rivelatore di massa (GC-MS); l’estrazione della frazione volatile è stata condotta tramite la tecnica della microestrazione in fase solida applicata allo spazio di testa del campione (HS-SPME).

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5.4.1. Procedura SPME

L’estrazione della frazione aromatica dei vini è stata condotta tramite HS-SPME utilizzando una fibra trifasica DVB/CAR/PDMS (Divinibenzene/Carboxen /Polidimetilsilossano) (Supelco, Bellefonte, PA, USA), con spessore del film 50/30 µm. Per l’estrazione sono stati usati 20 ml di vino posti all’interno di una vial da 40 ml munita di valvola “mininert” (Supelco, Bellefonte, PA, USA) che permette l’introduzione della fibra senza alcuna perforazione del setto. La vial così equipaggiata permette di evitare la presenza di picchi estranei dovuti a possibili perdite del setto. L'estrazione è stata effettuata per mezzo di una fibra, disponibile in commercio, montata su un holder manuale nello spazio di testa della vial che veniva mantenuta in un bagnomaria a 35°C (Supelco, Bellefonte, PA, USA). L’estrazione HS-SPME è stata eseguita esponendo la fibra nello spazio di testa del campione nelle seguenti condizioni sperimentali:

- Tempo di equilibratura - 15 minuti; - Tempo di estrazione - 15 minuti.

Durante l’estrazione il campione veniva mantenuto in continua agitazione per mezzo di un agitatore magnetico. Dopo l’estrazione, la fibra SPME veniva introdotta nell’iniettore (di tipo splitless) del GC/MS e mantenuta a 260°C per 3 minuti, al fine di consentire il desorbimento termico degli analiti nella colonna capillare del GC (Verzera et al. 2008).

5.4.2. Ottimizzazione della metodica

Per l’estrazione dei composti volatili mediante SPME sono disponibili in commercio diversi tipi di fibre che si differenziano per la natura chimica della fase stazionaria di cui sono costituite e dunque per la diversa affinità nei confronti delle diverse classi di composti. La fibra trifasica utilizzata (DVB/Carboxen/PDMS della Supelco), opera sia con un meccanismo di ripartizione sia, grazie alla presenza del Carboxen (substrato poroso), con un simultaneo meccanismo di adsorbimento consentendo, così, l’estrazione di tutti i composti di peso molecolare compreso tra 40 e 275 Dalton; proprio grazie alla sua capacità di trattenere le molecole più volatili ed in un ampio range di polarità, risulta adatta all’estrazione dei composti responsabili del flavor degli alimenti.

Nella messa a punto della metodica estrattiva da applicare ad una matrice complessa, quale il vino, le condizioni analitiche più idonee per un’efficiente estrazione (Kataoka et al. 2000), sono state fissate con numerose prove effettuate variando tutti i parametri che influiscono sull’efficienza della tecnica quali il tempo di esposizione della fibra allo spazio di testa, le condizioni e la temperatura di estrazione, il tempo e la temperatura di desorbimento della

59 fibra nell’iniettore del gascromatografo, ecc.; tali prove sono state condotte su uno stesso campione di vino. Le prove condotte per stabilire il tempo di equilibratura ed estrazione hanno evidenziato che un tempo complessivo pari a 15 + 15 minuti determinavano una maggiore efficienza estrattiva della maggior parte dei composti determinanti l’aroma, quali esteri e terepni, efficienza misurata considerando l’area dei picchi; tempi più lunghi non ne determinavano un aumento significativo. La temperatura scelta per l’estrazione è stata di 35°C che costituiva un buon compromesso tra aree dei picchi e possibilità di formazione di artefatti. La prova relativa al tempo di desorbimento ha mostrato che il risultato migliore si otteneva con un tempo di esposizione della fibra nell’iniettore del GC-MS pari a 3 minuti. Per quanto riguarda gli effetti della temperatura di desorbimento si è osservato che passando da 250°C a 260°C si registrava un aumento dell’area totale dei composti estratti, mentre nessuna differenza significativa si verificava tra 260°C e 270°C; le prove sono state condotte dunque alla temperatura di 260°C anche per ridurre lo stress termico della fibra. Infine, studi precedentemente da noi condotti su matrici differenti avevano dimostrato che la quantità di sostanze estratte risultava massima quando il rapporto tra il volume del campione e lo spazio di testa era pari ad 1, e che la sostituzione nelle vials dei setti di silicone con valvole “mininert” consentiva di ottenere profili cromatografici migliori, in quanto del tutto privi di picchi estranei dovuti alla contaminazione del setto.

5.4.3. Analisi GC-MS

Le analisi delle frazioni volatili estratte mediante SPME sono state eseguite con un gascromatografo interfacciato con uno spettrometro di massa Shimadzu GCMS-TQ8050 (Shimadzu Milano, Italia), equipaggiato con una colonna capillare in silice fusa CP-Wax, 60 m × 0,25 mm d.i. e con spessore del film di 0,25 µm (Chrompack Italia, Milano).

Le analisi sono state condotte nelle seguenti condizioni sperimentali: - Iniettore: splitless per 3 min e mantenuto alla temperatura di 260°C.

- Temperatura del forno: isoterma a 45°C per 5 min; incremento lineare di 10°C/min fino a 80°C; incremento lineare di 2°C/min fino a 240°C; isoterma a 240°C per 20 min.

- Gas di trasport: elio alla pressione costante di 10 psi. - Transfer line: 220°C.

- Tecnica di ionizzazione: impatto elettronico. - Range di acquisizione: 40-250 m/z.

60 - Libreria: NIST 14 (NIST / EPA / NIH Mass Spectra Library, version 2.0USA) e FFSNC 3 (Shimadzu).

5.4.4 Analisi qualitativa GC-MS

L’identificazione delle sostanze volatili è stata effettuata mediante:

- confronto dello spettro di massa della specie chimica incognita con quelli esistenti nella banca dati delle librerie;

- iniezione di standard, ove disponibili;

- confronto degli indici di ritenzione su colonna polare con le raccolte di indici riportati in letteratura.

Poiché le condizioni operative prevedevano l’analisi cromatografia in gradiente di temperatura, per il calcolo degli indici di ritenzione è stata utilizzata l’equazione in cui i termini logaritmici dell’equazione di Kovats sono sostituiti dai tempi di ritenzione (tr). Questa equazione, nota come l'equazione di Van den Dool e Kratz (1963), stabilisce una relazione lineare tra i tempi di ritenzione dei n-alcani e il numero di atomi di carbonio presenti nella loro molecola e consente di determinare i c.d. indici di ritenzione lineari (LRI). Per la determinazione dei tempi di ritenzione degli n-alcani è stata utilizzata una miscela di idrocarburi standard da n-C8 a n-C32 (Verzera et al., 2008).

Equazione di Van den Dool e Kratz

Ix = 100Z + 100 [( tr,x - tr,z )/(tr,z+1 -tr,z)]

dove:

Ix = indice di ritenzione della sostanza analizzata; tr = tempo di ritenzione;

x = sostanza analizzata;

z e z+1 = rappresentano i n-alcani adiacenti alla sostanza ed eluiti rispettivamente subito prima e subito dopo la sostanza stessa.

La ripetibilità del metodo è stata valutata calcolando, per ogni composto identificato, il coefficiente di variazione (CV%) dell’area del picco ottenuta in TIC da tre repliche dello stesso campione di vino. Il coefficiente di variazione risultava inferiore al 10% per tutti i componenti identificati.

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5.4.5 Analisi quantitativa GC-MS

L’analisi quantitativa è stata effettuata tramite la tecnica dello standard addition che risulta il metodo più adatto per determinare la concentrazione degli analiti in matrici complesse quali gli alimenti. Ogni analisi è stata condotta in triplo. Gli standard utilizzati sono stati forniti dalla Sigma-Aldrich Srl (Milano, Italia) alla massima purezza disponibile; per la quantificazione dei composti il cui standard non era disponibile, è stata utilizzata la curva di calibrazione del composto appartenente alla stessa classe chimica e con tempo di ritenzione e area del picco più simili possibili a quelli del composto da quantificare.