Analisi immunoenzimatica della -LG nativa e riscaldata in presenza di acido palmitico e retinolo.

Nel corso del presente lavoro, l’allergenicità della -LG sottoposta ai diversi trattamenti termici, è stata misurata adoperando delle analisi immunoenzimatiche quali il test ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) indiretto.

In questo tipo di esperimento, una quantità nota di antigene viene fatta aderire alla superficie dei pozzetti di una piastra di microtitolazione.

Una volta fissato, l’antigene reagisce con un anticorpo primario specifico e successivamente con un anticorpo secondario in grado di legarsi al complesso antigene- anticorpo. Il secondo anticorpo è coniugato con un enzima, solitamente una perossidasi, capace di interagire con un substrato per dare luogo ad una reazione di tipo colorimetrico. L’intensità della colorazione può essere misurata attraverso l’uso dello spettrofotometro.

Nel corso degli esperimenti sono stati utilizzati 4 anticorpi monoclonali primari, designati con il nome di mAb37, mAb96, mAb100 e mAb116, ottenuti dall’immunizzazione di topi [26].

Gli anticorpi monoclonali (mAb) costituiscono un insieme di anticorpi identici fra loro in quanto sono prodotti da linee cellulari provenienti dalla stessa cellula immunitaria (linfocita B). Dato un qualsiasi antigene, è possibile creare uno o più anticorpi monoclonali in grado di legare specificamente un suo determinante antigenico.

Gli anticorpi monoclonali, grazie alla loro sensibilità e specificità, costituiscono un valido strumento di ricerca per lo studio delle reazioni allergiche. Per questo motivo si è preferito adoperare questo tipo di anticorpi, piuttosto che il siero proveniente da pazienti allergici. Quest’ultimo infatti contiene al suo interno, anticorpi policlonali che a differenza dei monoclonali, forniscono una risposta eterogenea e meno specifica per quanto riguarda i singoli siti allergenici.

In Fig. 11 è riportata la rappresentazione schematica della struttura tridimensionale della -LG. In essa, sono localizzate le regioni riconosciute dai 4 anticorpi monoclonali.

Fig. 11: Rappresentazione schematica della struttura tridimensionale della -LG nella

quale sono localizzate le regioni riconosciute dai mAb 116, 100, 96, 37 [26].

Il grafico presente in figura 12 riporta invece il risultato del test ELISA, eseguito con la -LG nativa e riscaldata alle temperature di 65°, 75°, 85° C, in assenza di ligandi.

Test ELISA della -LG nativa e riscaldata alle temperature di

65°, 75° e 85° C 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1 2 3 4

1: mAb 116; 2: mAb 100; 3: mAb 96; 4: mAb 37.

A b s (3 60 n m ) _Nativa 65° C 75° C 85° C

La figura mostra come l’affinità della -LG nei confronti dei 4 anticorpi non subisca alcuna riduzione in seguito al trattamento termico.

Questo risultato, permette di ipotizzare che i cambiamenti conformazionali che avvengono non sono tali da indebolire la struttura della proteina e ridurre quindi la capacità degli anticorpi utilizzati di legare i relativi epitopi.

L’esperimento conferma inoltre che i quattro anticorpi monoclonali, soprattutto il 116 ed il 37, sono in grado di riconoscere epitopi conformazionali [26].

Prove analoghe sono state poi effettuate con la -LG riscaldata in presenza di retinolo e acido palmitico (figure 13, 14, 15).

Test ELISA della  -LG riscaldata a 65° C in presenza di acido

palmitico e retinolo 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1 2 3 4

1: mAb 116; 2: mAb 100; 3: mAb 96; 4: mAb 37.

A bs (3 60 n m ) Nativa 65° C 65° C + ac. Palmitico 65° C + Retinolo

Fig. 13: Risultato del test ELISA indiretto della -LG riscaldata alla temperatura di 65°

Test ELISA della -LG riscaldata a 75° C in presenza di acido palmitico e retinolo 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1 2 3 4

1: mAb 116; 2: mAb 100; 3: mAb 96; 4: mAb 37.

A b s (3 60 n m ) Nativa 75° C 75° C + ac. Palmitico 75° C + Retinolo

Fig. 14: Risultato del test ELISA indiretto della -LG nativa e riscaldata alla temperatura

di 75° contro gli anticorpi monoclonali 116, 100, 96, 37.

Test ELISA della -LG riscaldata a 85° C in presenza di acido

Palmitico e Retinolo 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1 2 3 4

1: mAb 116; 2: mAb 100; 3: mAb 96; 4: mAb 37.

A b s (3 60 n m ) Nativa 85° C 85° C + ac. Palmitico 85° C + Retinolo

Fig. 15: Risultato del test ELISA indiretto della -LG nativa e riscaldata alla temperatura

Queste prove, a differenza dei precedenti esperimenti, mostrano una diminuzione di affinità da parte degli anticorpi strettamente dipendente dalla temperatura e dal ligando utilizzato.

In particolare, l’acido palmitico sembra modificare la capacità dei quattro anticorpi di riconoscere i relativi epitopi, specialmente quando la proteina viene riscaldata a 65°C (figura 13). L’anticorpo monoclonale 116 sembra risentire maggiormente della presenza dell’acido palmitico (riduzione del 50% rispetto alla -LG nativa).

Alle temperature di 75° e 85°C, (Figure 14 e 15) tali variazioni non si rilevano.

Il retinolo invece diminuisce l’affinità’ dell’anticorpo 37, in particolare quando la -LG viene denaturata alla temperatura di 85° C.

E’ quindi possibile ipotizzare che, quando la -LG viene riscaldata alla temperatura di 65°C in presenza di acido palmitico e alla temperatura di 85°C in presenza di retinolo, nella struttura proteica avvengano dei cambiamenti tali da ridurre notevolmente la capacità degli anticorpi 116 e 37 rispettivamente, di riconoscere i relativi epitopi. Si può quindi dedurre che tale variazione di affinità comporti una diminuzione nell’allergenicità della -LG.

Capitolo IV: Conclusioni

L’argomento di ricerca della presente Tesi, è stato lo studio del meccanismo attraverso il quale la -LG sottoposta a trattamento termico, si denatura. Ciò è stato fatto allo scopo di individuare una tecnologia capace di ridurre il suo potere allergenico.

Durante il lavoro sono stati adoperati il dicroismo circolare, la spettroscopia di fluorescenza e le tecniche di separazione elettroforetica (Native-PAGE e SDS-PAGE), al fine di esaminare i cambiamenti strutturali provocati dal riscaldamento e dalla presenza di ligandi (retinolo, acido palmitico).

In particolare, dagli esperimenti è emerso che durante i trattamenti la presenza di un ligando all’interno della cavità idrofobica è in grado di accrescere la stabilità strutturale della -lattoglobulina. La presenza di tale molecola inoltre determina un più alto livello di dimerizzazione.

Questi due risultati sono apparentemente in contrasto tra loro. Infatti, affinché si formino dei dimeri stabili, è necessario che la molecola proteica subisca delle modificazioni in grado di rendere la C121 maggiormente esposta. Essa infatti è responsabile della formazione di ponti disolfuro tra due molecole di -LG

Tuttavia, per aumentare la reattività del residuo cisteinico, è sufficiente che i cambiamenti strutturali avvengano nella regione in cui si trova l’-elica. Pertanto i due fenomeni possono essere spiegati assumendo che, durante il trattamento termico, il

ligando stabilizzi il corpo centrale della -LG, ma allo stesso tempo, contribuisca ad allontanare l’-elica dal dominio principale della proteina.

Il test ELISA è stato adoperato per condurre le prove immunoenzimatiche volte a determinare le variazioni nell’allergenicità della -LG.

Durante gli esperimenti sono stati adoperati 4 anticorpi monoclonali, specifici per alcuni epitopi conformazionali, presenti nella molecola proteica. Tali epitopi sono formati da segmenti distanti in termini di sequenza primaria, ma vicini a livello di struttura terziaria, a causa del ripiegamento delle proteine. Pertanto, eventuali cambiamenti conformazionali possono destabilizzare questi complessi e ridurre la loro capacità di legarsi agli anticorpi.

I test allergenici, eseguiti sulla -LG trattata in assenza di ligandi, non hanno fornito risultati che mostrassero una significativa riduzione di allergenicità. Al contrario, il riscaldamento a determinate temperature in presenza di retinolo o di acido palmitico, ha ridotto la capacità di alcuni anticorpi monoclonali, di riconoscere i rispettivi epitopi. Questa variazione non è comunque sufficiente perchè non si scateni una reazione allergica nei pazienti sensibili.

In conclusione, il lavoro di questa tesi ha confermato mediante diversi approcci sperimentali, che la -lattoglobulina è una proteina dall’elevata stabilità strutturale. Pertanto se si vuole risolvere il problema dell’allergia senza l’uso di tecniche ricombinanti, è necessario ideare dei processi più drastici e mirati, rispetto alla semplice denaturazione termica.

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Vorrei ringraziare innanzitutto il Prof. Thomas Haertle per avermi dato l’opportunità di svolgere il mio lavoro di ricerca presso l’INRA di Nantes e il Prof. Paolo Pelosi, per la sua profonda disponibilità durante la stesura della Tesi.

La gratitudine più sincera spetta ai miei genitori e a mio fratello Stefano per non avermi mai fatto mancare sostegno e affetto.

Vorrei ringraziare inoltre i miei numerosi zii e cugini sparsi per l’Italia per il vivo interesse mostrato durante tutta la realizzazione della Tesi.

Un ulteriore ringraziamento va a Silvia, Claudia, Luca, Anna, Valeria, Bruno, Palè, Pierna e tutte le persone che durante questa esperienza universitaria ho avuto modo di conoscere e con le quali ho passato dei bei momenti.

Come dimenticarsi dei miei amici sardi Claudia, Laura, Francesca, Bob, Nicola e i due Andrea che da numerosi anni mi stanno vicino.

Penso che a questo punto sia giunto il momento di ringraziare Pierpa, la persona che con coraggio e spirito di sacrificio, mi sopporta ogni giorno! Grazie per il tuo sostegno, per la tua pazienza ma soprattutto per la tua infinita dolcezza!