sovrapposizioni delle curve di melting o presenza di picchi doppi generati da prodotti di amplificazione aspecifici. I primer definitivi hanno prodotto curve di melting con picchi separati specie-specifici, in un range di temperature da 68.5 a 80.8 °C.
Per la messa a punto del protocollo in multiplex sono state testate differenti polimerasi (paragrafo 6.7). Le migliori prestazioni in termini di specificità e di formazione di singoli picchi caratterizzanti la specie è stata ottenuta con l’utilizzo di QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Qiagen) senza l’aggiunta di nessun reagente supplementare. Il Kit, però, ha rivelato alcune limitazioni relativamente all’amplificazione delle sequenze più lunghe, come quella di L. piscatorius e L. vomerinus, dai quali si ottenevano dei picchi aspecifici. Anche se è possibile ottenere amplificati della lunghezza di 300 pb, la lunghezza ottimale di un amplicone è inferiore a 150 pb, alcuni autori suggeriscono perfino di ridurla fino ad 80 pb per l’ottenimento di migliori risultati. Gli ampliconi più brevi, difatti, amplificano in modo più efficiente rispetto a quelli più lunghi e sono più tolleranti a condizioni di reazione non perfettamente ottimali (Rodriguez et al. 2013). Per ovviare al problema della lunghezza sono state effettuate alcune prove aggiungendo alla mix di reazione la polimerasi utilizzata nel protocollo end-point, la SubTherm TAQ Polymerase (0.25 U). I
risultati delle PCR effettuate in tali condizioni hanno mostrato la presenza di picchi corrispondenti alle temperature di melting più elevate, ovvero quelle relative alle sequenze più lunghe. Questo dimostra come si possa sfruttare l’azione sinergica di due tipologie di polimerasi distinte per consentire l’amplificazione di sequenze con caratteristiche molto diverse, in determinate condizioni di reazione.
Al fine di equilibrare la reazione e l’efficienza di amplificazione sulle singole specie sono state valutate differenti concentrazioni di primer. Inoltre sono state testate concentrazioni crescenti di MgCl2. Le migliori performance sono state ottenute con una concentrazione
2.5 mM. In ultimo sono stati comparati i risultati ottenuti variando la concentrazione di DNA iniziale (100, 50, 25, 12.5 e 6.25 ng per 10 ul totali di miscela di reazione). I risultati migliori in termini di curva di melting (conseguente anche al punto di take off) sono stati ottenuti con 25 ng.
Il protocollo per la PCR real-time da noi messo a punto ha permesso di ottenere curve di melting caratteristiche per ciascun amplificato preso in considerazione (Figura 17). Una certa distanza fra i picchi è indispensabile per garantire la non sovrapposizione degli stessi anche in caso di minime variazioni intraspecifiche casuali nella sequenza nucleotidica dell’amplificato (polimorfismi intraspecie ignoti), che potrebbero comportare un certo spostamento delle temperature di melting. È da considerare che più lunga è la sequenza da amplificare, maggiore sarà la probabilità di trovare una o più mutazioni nella sequenza stessa. D’altra parte, più lunga è la sequenza, minore sarà il cambiamento che la mutazione indurrà nella curva analizzata (Gundry et al. 2003). Nel nostro lavoro le temperature di melting delle sequenze amplificate sono diverse per ogni specie, tanto da riuscire ad ottenere, applicando il protocollo finale, sette picchi distinti e separati, permettendo di discriminare in modo chiaro tutte le specie di Lophius (Figura 17). Per il raggiungimento di tale risultato sono stati disegnati più primer per ogni specie. Come per esempio per L.
litulon sono stati progettati LIT1, LIT2. LIT3, LIT4 e LIT5 e dopo varie prove di
ottimizzazione, è stato scelto LIT2 per il protocollo finale, in quanto ha prodotto un amplificato con un picco equamente distanziato tra quello della specie che lo precede (L.
gatrophysus) e da quello che lo segue (L. americanus), pur mantenendo una buona
efficienza di amplificazione. La stesse considerazioni sono state fatte per la scelta di BUD2 e degli altri primer.
Figura 17- Analisi della curva di melting dopo l’amplificazione in PCR real-time delle sette specie di
Lophius. a: L. gastrophysus; b: L. litulon; c: L. americanus; d: L. budegassa; e: L. vaillanti; f: L. vomerinus; g: L. piscatorius.
Anche in real-time è stata prevista la reazione con i primer di controllo (COILfor e COILrev) che ha prodotto dei picchi, differenti per ogni specie, in un range di temperature da 81.5 e 83.1 °C (Figura 18).
Figura 18- Analisi della curva di melting dopo la multiplex PCR real-time. Sulla sinistra sono visualizzati gli
amplificati di qualche specie utilizzata come controllo negativo h: Solea solea; i: Liza aurata; j: Lophius
caulinaris; k: acqua. Sulla destra sono visualizzate le sette specie di Lophius amplificati con i primer
La PCR multiplex real-time è stata applicata quindi ai campioni di DNA totale ottenuti dalle specie utilizzate come controllo negativo, i risultati sono visibili in Figura 18. Non sono presenti dei picchi netti. Le curve visibili a basse temperature sono probabilmente dovute alla dimerizzazione dei primer e/o all’instaurarsi di reazioni aspecifiche messe in evidenza dal colorante SYBRgreen, che si intercala in modo aspecifico in presenza di qualsiasi frammento di (double strand) dsDNA. Alcune specie testate (Solea solea, Liza
aurata, e Lophiidae) mostrano piccoli picchi ad una temperatura simile a quella di L. litulon, ma senza mai raggiungere la nitidezza di un picco vero. A conferma di quanto
detto anche l’amplificazione con i primer di controllo COILrev e COILfor ha fornito sempre esito negativo.
Capitolo
5
Conclusioni
Entrambe le metodiche di PCR multiplex sviluppate in questo studio, una secondo un protocollo end-point e l’altra secondo un protocollo real-time con analisi post- amplificazione della curva di dissociazione del DNA, si sono rivelate idonee per l’identificazione delle sette specie appartenenti al genere Lophius.
Tali metodiche apportano migliorie, rispetto a quelle già esistenti, in termini di costi e semplicità di esecuzione. Inoltre, l’utilizzo del protocollo real-time consente di ridurre ulteriormente i tempi di analisi, possibilità particolarmente importante nel caso in cui si debbano identificare prodotti facilmente deperibili venduti freschi.
Pertanto, in relazione alla attrezzature e al budget disponibile dal laboratorio, sarebbe possibile adottare sia l’una che l’altra metodica come strumento analitico di routine da utilizzare per la verifica dell’autenticità delle informazioni riportate in etichetta e garantire, in tal modo, il rispetto delle leggi in materia di tracciabilità e rintracciabilità dei prodotti alimentari, salvaguardando il commercio leale, la pesca regolamentata e i diritti del consumatore.
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