Le analisi morfologiche fatte sui preparati istologici realizzati sull’epitelio colturale (FIG 26),

confermano le ipotesi sostenute con le misure dei TEER, con i seguenti risultati: 1) Alla concentrazione di 0,10mg/ml di -Tocoferolo (FIG. 26 A, B, C). L'epitelio non mostra segni di modificazioni morfologiche ed è perfettamente analogo a quella di un epitelio enterico normale. 2)Alla concentrazione 0,20mg/ml di -Tocoferolo (FIG.26 D, E, F), la coltura cellulare si presenta

200 400 600 800 1000 0' 30' 60' 90' 120' 150' 210' T EE R ( O hm x c m 2 ) Tempo controllo 0,1 0,2 0,3 0,4

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con un quadro infiammatorio moderato ma reversibile in cui si evidenziano uno swelling citoplasmatico con contestuale picnosi e rare cellule apoptotiche.

3)Alla concentrazione di 0,30 mg/ml di -Tocoferolo (FIG. 26 G, H, I). si nota un grande cambiamento morfologico con un evidente danno ossidativo che coinvolge il monostrato di cellule e si estende fino ai nuclei. Questi ultimi mostrano una serie di modifiche che vanno dalla picnosi fino ad una grave carioressi e conseguente cariolisi associata. Questi cambiamenti sono per lo più osservati a 210' in cui si osserva un epitelio ormai in necrosi estesa, con una morfologia tipica di un danno irreversibile la cui conseguenza finale è la morte cellulare.

4)Aumentando la concentrazione di -tocoferolo a 0.40mg/ml (FIG. 4 L, M, N), contrariamente al quadro necrotico atteso come conseguente alla precedente osservazione, abbiamo osservato un progressivo sdifferenziamento cellulare e la relativa perdita della polarizzazione cellulare, tale morfologia atipica di tipo trasformazionale è caratteristica di un epitelio pluristratificato con una clustery cellulare tipica di una trasformazione cellulare in atto data da una iperproliferazione di cellule atipiche del tutto paragonabile ad un quadro di morfologia neoplasica. Questa nostra ultima osservazione morfologica se confrontata con la (FIG. 4 L, M, N), ci conferma che alla concentrazione di -tocoferolo di 0,4mg/ml la curva della misura dei TEER cambia inclinazione in quanto i valori della resistenza transepiteliale aumentavano e tale incremento poteva essere considerato come un possibile recupero (recovery) delle cellule del monolayer colturale. E’ stata dunque discriminante la contestuale analisi istologica per evidenziare che non si aveva il recupero ma altresì la trasformazione dell’ epitelio differenziato del modello cellulare in un epitelio trasformazionale in cui una delle caratteristica intrinseche delle cellule è quella di perdere l’inibizione da contatto e di proliferare in maniera anomala e pluristratificata, questa crescita determina come conseguenza un aumento del valore nella misura dei TEER che senza la verifica istologica avrebbe potuto creare la falsa ipotesi di una possibile azione di tipo antiinfiammatorio della sostanza testata mentre in questo caso è l’esatto contrario FIG.26-N. A tal fine possiamo affermare che ogni volta che il modello cellulare in vitro presenta valori dei TEER incongrui sarebbe necessario eseguire l’analisi istologica dell’epitelio colturale in toto per confermare o no lo stato di salute del monolayer. Queste prime osservazioni ci hanno fornito una serie di dati dell’attività dell’-tocoferolo sul modello in vitro costituito dalla linea cellulare Caco-2. Essendo questa una molecola liposolubile con un intake passivo sulle cellule del monolayer colturale ha provocato un cambiamento dell’attività in funzione della concentrazione, che da un comportamento antiossidante alle concentrazioni di 0,1-0,2 mg/ml, si e passati ad avere un azione fortemente pro-ossidante alle concentrazioni di 0,3-0,4 mg/ml di (Vit.E).

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FIG.26 Analisi istologica dell’epitelio colturale alle varie concentrazioni crescenti di - tocoferolo vit. E:

Abbreviazioni:

AAPH= 2,2’-Azo-bis(2-amidinopropane) dihydrochloride, AMUC= Atypical morphologic undifferentiated cells, AP= Apoptosys ,CSW= Cytoplasmic swelling, DCN= Depholiant cells necrotic, IPS= Hyperchromatic straining, KL= Karyolysis, KR= Karyorrhexis, ND= Nuclear Damage NE= Necrosis, NPC= Nuclear picnosis, VD=

Vacuolar degeneration , la barra della FIG.A equivale ad un ingrandimanto 10m. Aut. Fabio Nobili

Come precedentemente riferito, nella descrizione generale dell’attività della ricerca proposta in questa prima fase sperimentale è stata stigmatizzata una curva di tolleranza su un sistema che risultava essere in equilibrio, infatti le cellule costituenti il modello colturale su cui si è realizzata

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questa prima fase sperimentale si trovavano in un ambiente fisiologico ottimale paragonabile a quelle di un apparato intestinale di un organismo umano sano. Confortati da questi primi risultati ci siamo prodigati ad eseguire una seconda parte sperimentale in cui le stesse concentrazioni di - tocoferolo sono state somministrate sullo stesso modello in vitro ma in condizioni fisiologiche completamente differenti in cui il monolayer colturale era stato sottoposto preventivamente ad uno stress ossidativo in maniera da simulare un eventuale stato patologico (patia), tale stato infiammatorio è stato indottocon l’aggiunta al mezzo di coltura apicale (FIG.21), di una sostanza radicalizzante il 2,2’ azobis (2-amidinopropane)dihydrochloride (AAPH). L’esecuzione di questa fase sperimentale ha prodotto un risultato veramente interessante, come è possibile constatare all’osservazione del grafico in (FIG. 27). Le concentrazioni di vitamina E, di 0,2-0,3 mg/ml che risultavano tossiche nel modello colturale in equilibrio sono quelle che nel modello con stress ossidativo indotto sono risultate le più idonee a contrastare l’azione del 2,2’ azobis (2- amidinopropane) dihydrochloride, al punto di far recuperare l’intero epitelio. La concentrazione 0,1 mg/ml e quella di 0,4 mg/ml sono risultate la prima insufficiente a contrastare l’insulto ossidativo, e la seconda invece ha agito come un pro-osidante che in associazione con il radicalizzante da noi aggiunto ha fatto precipitare il monolayer colturale in un quadro necrotico irreversibile (24).

FIG.27 Curva dell’-Tocoferolo a concentrazioni crescenti in presenza dell’oxidante 2,2’ azobis (2-amidinopropane)dihydrochloride (AAPH)

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0' 30' 60' 90' 120' 150' 210' controllo 0,1mg/ml 0,2mg/ml 0,3mg/ml 0,4mg/ml oxi 6mg/ml Minuti -Tocoferolo TEER O hm x C m 2

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La conferma di questi risultati si è avuta dall’analisi istologica che è stata eseguita per ogni campione (FIG.28), in cui i cambiamenti morfologici subiti dal monolayer cellulare hanno confermato i dati della misura della resistenza trans epiteliale (TEER). Nella FIG.28 le immagini A,B,C sono il Controllo, mentre le immagini D,E,F rappresentano il solo radicalizzante, a seguire sono rappresentate le concentrazioni crescenti in -Tocoferolo 0,1-0,2-0,3-0,4.

Dalla FIG.28 è facilmente riconoscibile che la concentrazione 0,3 mg/ml è quella che riesce a compensare in maniera efficiente il danno ossidativo dato dall’azione del 2,2’ azobis (2- amidinopropane)dihydrochloride, infatti nelle figure P-Q-R si evince un progressivo miglioramento della coltura cellulare che riesce ad eseguire un recovery totale come evidenziato nella foto R in cui la morfologia cellulare assume lo stesso aspetto conformazionale del controllo (FIG.22-B).

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FIG.28 Istologia del monolayer cellulare A-C = Controllo, D-F solo AAPH - 0,1-0,2-0,3-0,4 mg/ml di vit.E + AAPH 6 mg/ml

Abbreviazione: La barra in figura 26-A e in figure 28-A rappresenta l’ingrandimento del valore di 10m. AAPH= 2,2’-Azo-bis(2-amidinopropane) dihydrochloride, AMUC= Atipic morphologic undifferentiated cells. AP= Apoptosys, CSW= Cytoplasmic swelling, DCN= Depholiant cells necrotic, IPS= Ipercromatic staining KL= Karyolysis. KR= Karyorrhexis, NE= Necrosis, NPC= Nuclear picnosis, VD= Vacuolar degeneration. Aut. Fabio Nobili

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