Analisi del numero di cellule epidermiche nei cotiledoni delle

Usando un microscopio a contrasto per interferenza differenziale (DIC) è stato analizzato il numero di cellule dell’epidermide adassiale nei cotiledoni delle linee transgeniche sovraesprimenti i fattori di trascrizione DcE2F, AtE2Fa, AtE2Fb e wild type (Col-0). Come per l’analisi delle dimensioni cotiledonari, sono stati presi in considerazione due diversi stadi di sviluppo: nel primo (stadio I) è presente l’abbozzo della prima coppia di foglioline ed i cotiledoni stanno ancora crescendo; nel secondo (stadio II) i cotiledoni hanno raggiunto le dimensioni finali ed è presente l’abbozzo della seconda coppia di foglioline.

Per quanto riguarda lo stadio di sviluppo I è stato osservato il numero di cellule epidermiche per unità di area (100000 µm2) di 27 cotiledoni delle piantine transgeniche sovraesprimenti il fattore DcE2F (14 cotiledoni della linea #13 e 13 cotiledoni della linea #16), 35 cotiledoni delle piantine sovraesprimenti AtE2Fa (15 cotiledoni della linea #1 e 20 cotiledoni della linea #5) e 45 cotiledoni delle piantine sovraesprimenti AtE2Fb (32 cotiledoni della linea #7 e 13 cotiledoni della linea #13). Questi risultati sono stati confrontati con i dati ottenuti dall’osservazione di 11 cotiledoni delle piantine wild type allo stesso stadio di sviluppo. Come mostrato nella Tabella 30 e nella Figura 49, si è osservato che il numero di cellule epidermiche per unità di area nei cotiledoni delle linee transgeniche sovraesprimenti i fattori E2F è quasi raddoppiato rispetto a quello dei cotiledoni delle wild type. Conseguentemente, le dimensioni medie cellulari sono all’incirca dimezzate. Poichè, come descritto prima, la dimensione media dell’intero organo appare abbastanza invariata a questo stadio di sviluppo, questi dati sono indicativi di un forte aumento della proliferazione cellulare nei cotiledoni delle linee sovraesprimenti i fattori E2F.

Linea # N° medio di cellule in 100000 µm2 Dimensione media cellulare (µm2₎ DcE2F 13 50,1 ± 0,7 1996,00 ± 27,9 DcE2F 16 50,3 ± 3,0 1988,07 ± 118,6 AtE2Fa 1 49,6 ± 2,2 2016,13 ± 89,4 AtE2Fa 5 42,9 ± 2,3 2331,00 ± 125,0 AtE2Fb 7 43,5 ± 1,2 2298,85 ± 63,4 AtE2Fb 13 42,6 ± 1,3 2347,42 ± 71,6 Col-0 24,5 ± 1,5 4081,63 ± 249,9

Tabella 30. Numero medio di cellule epidermiche adassiali per unità di area e dimensione media delle cellule epidermiche nei cotiledoni delle linee transgeniche sovraesprimenti i fattori di trascrizione DcE2F, AtE2Fa, AtE2Fb e di piantine wild type allo stadio di sviluppo I (± SE=SD/√n).

Figura 49. Numero medio di cellule epidermiche adassiali per unità di area nei cotiledoni delle linee transgeniche sovraesprimenti i fattori di trascrizione DcE2F, AtE2Fa, AtE2Fb e delle piantine wild type allo stadio di sviluppo I. Le barre d’errore indicano l’errore standard (SE=SD/√n).

Per quanto riguarda lo stadio di sviluppo II (cotiledoni maturi, abbozzo seconda coppia di foglioline) l’analisi è stata effettuata su 50 cotiledoni delle piantine transgeniche sovraesprimenti il fattore DcE2F (28 cotiledoni della linea #13 e 22 cotiledoni della linea #16), 14 cotiledoni delle piantine sovraesprimenti AtE2Fa (11 cotiledoni della linea #1 e 3 cotiledoni della linea #5), 15 cotiledoni delle piantine sovraesprimenti AtE2Fb (12 cotiledoni della linea #7 e 3 cotiledoni della linea #13) e 18 cotiledoni delle piantine wild type allo stesso stadio di sviluppo (Tab. 31; Fig. 50). Anche in questo caso, come nell’osservazione delle piantine al primo stadio di sviluppo, si è osservato che il numero di cellule epidermiche per unità di area nei cotiledoni delle linee transgeniche sovraesprimenti i fattori E2F è notevolmente maggiore (da 1,5 a 2 volte in più) rispetto a quanto rilevato nei cotiledoni wild type. Conseguentemente, anche nel secondo stadio di sviluppo le dimensioni medie delle cellule epidermiche, seppur notevolmente aumentate rispetto al primo stadio, rimangono fortemente inferiori nelle linee sovraesprimenti i fattori E2F.

Linea # N° medio di cellule in 100000 µm2 Dimensione media cellulare (µm2) DcE2F 13 30,9 ± 1 3236,25 ± 104,7 DcE2F 16 26,3 ± 0,8 3802,28 ± 115,7 AtE2Fa 1 33,6 ± 1,2 2976,19 ± 106,3 AtE2Fa 5 31,1 ± 1,7 3215,43 ± 175,8 AtE2Fb 7 35,7 ± 1,1 2801,12 ± 86,3 AtE2Fb 13 32,2 ± 3,3 3105,59 ± 318,3 Col-0 18,2 ± 0,7 5494,51 ± 211,3

Tabella 31. Numero medio di cellule epidermiche per unità di area e dimensione media delle cellule epidermiche nei cotiledoni delle linee transgeniche sovraesprimenti i fattori di trascrizione DcE2F, AtE2Fa, AtE2Fb e delle piantine wild type allo stadio di sviluppo II (± SE=SD/√n).

Figura 50. Numero medio di cellule epidermiche adassiali per unità diarea nei cotiledoni delle linee transgeniche sovraesprimenti i fattori di trascrizione DcE2F, AtE2Fa, AtE2Fb e delle piantine wild type allo stadio di sviluppo II. Le barre d’errore indicano l’errore standard (SE=SD/√n).

Calcolando il numero medio totale di cellule presenti nell’epidermide adassiale dei cotiledoni ai due diversi stadi di sviluppo risulta, come descritto nella Tabella 32 e nella Figura 51, che allo stadio I i cotiledoni delle linee sovraesprimenti i fattori E2F presentano forti aumenti del numero di cellule rispetto ai cotiledoni wild type, con variazioni che vanno da un minimo del 44% in più (DcE2F #16) fino al 125% (DcE2F #13), mentre allo stadio II gli aumenti sono ancora più marcati e vanno da un minimo del 77% in più (AtE2Fb #13) fino al 198% di aumento (AtE2Fa #5). Inoltre, è interessante notare che nel passaggio dallo stadio I a quello finale (stadio II) il numero medio totale di cellule epidermiche aumenta solo del 15% nei cotiledoni wild type, a conferma del fatto che durante la germinazione l’accrescimento cotiledonare è fortemente collegato alla distensione e non alla proliferazione cellulare. Tuttavia, nei cotiledoni delle linee transgeniche si rilevano aumenti molto maggiori del numero totale di cellule epidermiche adassiali, che arrivano a raddoppiare nel caso della linea AtE2Fa #5 (106%) ed indicano che la sovraespressione dei fattori E2F “attivatori” è in grado di indurre un incremento della proliferazione cellulare nei cotiledoni anche durante le fasi successive alla germinazione.

Linea # N° medio totale di cellule nello stadio I

N° medio totale di cellule nello stadio II

Incremento dallo stadioI allo stadioII DcE2F 13 1102,2 ± 100,2 1359,6 ± 61,8 23 % DcE2F 16 704,2 ± 100,6 1183,5 ± 52,6 68 % AtE2Fa 1 892,8 ± 99,2 1478,4 ± 168,0 66 % AtE2Fa 5 815,1 ± 85,8 1679,4 ± 93,3 106 % AtE2Fb 7 913,5 ± 43,5 1285,2 ± 32,7 41 % AtE2Fb 13 766,8 ± 42,6 998,2 ± 128,8 30 % Col-0 490,0 ± 24,5 564,2 ± 36,4 15 % Tabella 32. Numero medio totale di cellule epidermiche adassiali nei cotiledoni delle

linee transgeniche sovraesprimenti i fattori di trascrizione DcE2F, AtE2Fa, AtE2Fb e delle piantine wild type ai due stadi di sviluppo (± SE=SD/√n).

Figura 51. Numero medio totale di cellule dell’epidermide adassiale nei cotiledoni delle linee transgeniche sovraesprimenti i fattori di trascrizione DcE2F, AtE2Fa, AtE2Fb e delle piantine wild type ai due stadi di sviluppo. Le barre d’errore indicano l’errore standard (SE=SD/√n).

4.4.3. Misurazione dell’area delle cellule epidermiche nei cotiledoni