Analisi proteomica

L’analisi proteomica è stata eseguita come di seguito indicato, presso il Laboratorio di Proteomica di Porto Conte Ricerche, Parco Scientifico e Tecnologico della Sardegna (Tramariglio, Alghero).

3.2.2.1 Estrazione delle proteine

Le proteine sono state estratte da 1x109 cellule tramite incubazione a 95°C per 20 minuti in agitazione (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Amburgo, Germania) in tampone di estrazione (1% SDS, 20 mM Tris-HCl pH 8.8), seguita da distruzione meccanica, combinata a cicli di congelamento-scongelamento, effettuata con l’ausilio di un omogeneizzatore meccanico TissueLyser (Qiagen, Hilden, Germania). Gli estratti proteici sono stati sottoposti a precipitazione con il 2D-Clean up Kit (GE Healthcare). La quantificazione delle proteine è stata effettuata mediante l’EZQTM Protein Quantitation Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA).

3.2.2.2 Elettroforesi bidimensionale

Per l’analisi DIGE, la marcatura è stata effettuata incubando 50 μg di proteine di ciascun campione con 400 pmol di CyDye DIGE Fluors 3 e 5 (GE Healthcare/Amersham, Little Chalfont, Regno Unito) per 30 minuti in ghiaccio al buio. In parallelo, una miscela di tutti i campioni di ogni singolo esperimento è stata marcata con CyDye DIGE Fluor 2 (sempre 400 pmol di cianina per 50 μg di proteine) ed utilizzata come standard interno. La reazione è stata bloccata incubando ciascun campione con 1 μL di Lisina 10 mM per 10 minuti.

I campioni sono stati quindi miscelati in base alle combinazioni previste dallo schema DIGE, come dettagliato nei risultati. Alla miscele sono stati aggiunti ditiotreitolo (DTT) ed anfoline (con range di pH 3-11 non lineare), entrambi ad una concentrazione finale dell’1% p/v, ed in seguito la soluzione è stata portata ad un volume finale di 450 μL (200 μL nel caso delle strip da 11 cm) con la DeStreak Rehydration Solution (contenente Urea; Glicerolo; CHAPS; GE Healthcare). Le IPGstrip da 24 cm (GE Healthcare) o da 11 cm (Bio-Rad), con range di pH

Raffaela Cutzu. Produzione di carotenoidi in Rhodotorula glutinis su glicerolo.

Tesi di dottorato in Biotecnologe microbiche agroalimentari, Scuola di dottorato di ricerca in Scienze e Biotecnologie dei Sistemi Agrari e Forestali e delle Produzioni Alimentari.

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3-11 non lineare, utilizzate per la prima dimensione sono state quindi reidratate con il campione mediante reidratazione passiva overnight. L’isoelettrofocalizzazione è stata condotta utilizzando l’IPGphor3 (GE Healthcare).

Prima della seconda dimensione, le IPGstrip sono state riequilibrate per immersione (15 minuti, lenta agitazione) in una soluzione riducente di DTT 2% p/v in tampone di equilibratura (Urea 6 M, Tris-HCl pH 8,8 0,50 mM; Glicerolo 30% v/v; SDS 2% p/v). In seguito all’allontanamento dell’eccesso della soluzione riducente, le IPGstrip sono state sottoposte a due passaggi consecutivi, di 8 minuti circa ciascuno, di alchilazione in una soluzione alchilante contenente iodoacetamide (IAA) 2,5% p/v in tampone di equilibratura. Le strips contenenti i campioni marcati con le cianine sono state protette dalla luce per tutta la durata della reidratazione in modo da non comprometterne la fluorescenza.

Per la seconda dimensione sono stati utilizzati gel di poliacrilamide a concentrazione fissa 12,5% per le strips da 24 cm e in gradiente 4-20% per le strip da 11 cm. La corsa elettroforetica è stata effettuata overnight alla temperatura costante di 25°C, impostando una potenza pari ad 1 W per gel, utilizzando la Ettan DALTTwelve (GE Healthcare) per le strip da 24 cm e la Criterion Dodeca Cell (Bio-Rad) per le strips da 11 cm.

Le immagini dei gel sono state acquisite mediante Typhoon Trio+ Image Scanner (GE Healthcare) ed analizzate con il software DeCyder (v.7.0, GE Healthcare), utilizzando i moduli BVA (Biological Variation Analysis) e EDA (Extended Data Analysis).

Per l’escissione degli spots di interesse, 600 µg di proteine per ciascun ceppo sono state separate tramite 2-D PAGE su strips da 24 cm (GE Healthcare) per la prima dimensione e su gel a concentrazione fissa di poliacrilammide (12,5%) per la seconda dimensione, seguendo un protocollo identico a quello adottato per la 2-D DIGE eccetto la marcatura con cianine fluorescenti. In seguito a colorazione con blue di Coomassie, gli spots di interesse sono stati sottoposti a idrolisi in situ con tripsina secondo un protocollo standard (Shevchenko et al., 2006).

3.2.2.3 Spettrometria di massa

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lo spettrometro di massa ad alta risoluzione LTQ-Orbitrap Velos accoppiato con il sistema nanoUPLC UltiMate 3000 (Thermo Scientific, San Jose, USA) o, in alternativa, lo spettrometro di massa XCT Ultra 6340 ion trap interfacciato con un sistema HPLC 1200 ed un “chip cube” (Agilent Technologies, Palo Alto, USA), secondo procedure riportate rispettivamente da Tanca et al. (2013) ed Addis et al. (2012).

3.2.2.4 Analisi dei dati di spettrometria di massa

L’identificazione delle proteine è stata effettuata mediante la piattaforma bioinformatica Proteome Discoverer (v.1.4, Thermo Scientific), utilizzando il motore di ricerca integrato Sequest-HT con i parametri descritti di seguito (un secondo valore è riportato tra parentesi qualora l’analisi dei dati ottenuti con lo spettrometro di massa Agilent richiedesse parametri differenti rispetto all’analisi dei dati Orbitrap): enzima: tripsina; massimo numero di siti di taglio saltati: 2; tolleranza sulla massa dello ione precursore: 10 (250) ppm; tolleranza sulla massa dello ione frammento: 0.02 (0.5) Da; modificazioni statiche: carbamidometilazione della cisteina; modificazioni dinamiche: conversione della glutammina N-terminale in acido piroglutammico e ossidazione della metionina. La significatività dell’identificazione è stata determinata mediante il tool “Fixed Value Peptide Validator” presente nella suite di Proteome Discoverer, utilizzando i parametri di default, e sono state considerate soltanto le identificazioni ad alta confidenza. Inoltre, i peptidi con valore di rank superiori ad 1 non sono stati considerati nell’analisi.Di seguito sono riportati i nomi e le caratteristiche dei sette differenti database proteici utilizzati per l’identificazione. Sono stati utilizzati sia database recentemente pubblicati e ricavati da sequenze genomiche di specie affini (nello specifico, Rhodosporidium toruloides), sia database generati a partire da dati di sequenziamento genomico (specificamente, quelli ottenuti in seguito al sequenziamento parziale del ceppo C2.5T1, effettuato con tecnologia Illumina HiScanSQ presso i laboratori di Porto Conte Ricerche), sia database pubblici filtrati in base ad informazioni tassonomiche o funzionali. In particolare, per quanto riguarda il database “Rhodotorula-6FT”, le sequenze genomiche sono state processate secondo la strategia della six-frame translation (tramite lo script translateWholeGenomeMultiChromosome.pl disponibile nel sito

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http://proteomics.ucsd.edu/Downloads), in modo da favorire la presenza di sequenze proteiche non identificabili utilizzando i classici algoritmi di gene finding, sulla base di un approccio proteogenomico in senso stretto (Armengaud et al., 2013). Per quanto riguarda invece il database “UniProtKB-beta-carotene”, è stata effettuata una ricerca preliminare tra le entries del database UniProtKB diretta agli enzimi putativamente coinvolti nei diversi stadi della via carotenogenica, a partire dall’ acetil-CoA C-acetiltransferasi fino alla licopene ciclasi, indipendentemente dall’organismo di provenienza; dall’insieme delle proteine presenti in database che soddisfacessero il criterio di ricerca è stato generato un file fasta, utilizzato successivamente come database per l’identificazione proteica.

Tabella 1. Database utilizzati per l’identificazione proteica a partire dai dati di spettrometria

di massa.

Nome Origine Processamento N° di

sequenze

Rhodosporidium Zhu et al., 2012 annotazione

NCBI/UniProtKB/KEGG

8157

Rhodotorula-TrEMBL sequenze genomiche ottenute in house sul ceppo C2.5T1

annotazione

UniProtKB/TrEMBL

24387

Rhodotorula-KOG sequenze genomiche ottenute in house sul ceppo C2.5T1

annotazione KOG 24387

Rhodotorula-6FT sequenze genomiche ottenute in house sul ceppo C2.5T1

six-frame translation 40608

UniProtKB-beta-carotene UniProtKB (v.2013_11) selezione enzimi della via carotenogenica

24048

UniProtKB-fungi UniProtKB (v.2013_11) selezione proteine fungine 2147770 UniProtKB-bacteria UniProtKB (v.2013_11) selezione proteine batteriche 37057423

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