Analisi quantitativa mediante Real Time PCR dell’espressione dei marcatori neuronali in cellule esposte al campo di 29 Hz, 1mT

In figura 15 è mostrata l’analisi quantitativa effettuata mediante Real Time PCR dei livelli di espressione dell’mRNA di alcuni marcatori precoci (NeuroD e Nestina) e tardivi (NR1 e TAU) del differenziamento neuronale normalizzatati rispetto al gene GAPDH. Per ogni marcatore (NeuroD, Nestina, NR1, TAU) è mostrato l’andamento dell’espressione dell’mRNA estratto dalle cellule NT2 di controllo ed esposte al campo di 29Hz, 1mT (Fig. 15.A, C, E, G) e poi confrontate con le cellule differenziate con Acido Retinico 1µM (Fig. 15.B, D, F, H).

Il campo ELF-EMF determina nelle cellule esposte un graduale aumento dell’mRNA per il fattore di trascrizione NEURO D a 7, 14, 21 giorni e questo incremento è statisticamente significativo rispetto al controllo (Fig. 15.A). Al contrario nelle NT2 differenziate con Acido Retinico il marcatore è fortemente up regolato a 7 giorni ma la sua espressione diminuisce nei tempi successivi e a 21 giorni il suo valore si avvicina a quello dei campioni esposti al campo (Fig. 15.B).

L’mRNA della nestina risulta essere up regolato dopo 7 giorni di esposizione al campo di 29Hz, 1mT e a 14 giorni questo valore subisce una lieve diminuzione mantenendosi però piuttosto costante fino ai 21 giorni (Fig.15.C). L’andamento ed i valori dell’espressione della nestina nelle cellule esposte sono molto simili a quelli osservati nelle cellule differenziate con Acido Retinico. Successivamente ad un forte aumento dell’espressione del marcatore a 7 giorni, si osserva però a 21 giorni, a differenza dei campioni esposti al campo ELF-EMF, una sua progressiva diminuzione (Fig.15.D).

Il campo di 29Hz, 1mT induce un graduale incremento dell’espressione dei marcatori tardivi NR1 (Fig.15.E) e TAU (Fig.15.G) rispetto ai controlli e questi valori sono statisticamente significativi. L’andamento della espressione dei due marcatori è simile a quella osservata nelle cellule differenziate con Acido Retinoico nei quali però gli mRNA di NR1(Fig.15.F) e TAU (Fig.15.H) sono maggiormente espressi.

Fig.15. Analisi quantitativa mediante Real Time PCR dell’espressione dei marcatori del differenziamento neuronale Neuro D (A, B), Nestina (C, D), NR1 (E, F), TAU (G, H). Nei pannelli A, C, E, G è mostrato l’incremento dell’mRNA rispetto al controllo endogeno GAPDH dei campioni di controllo (ctr) ed esposti al campo di 29Hz, 1 mT (exp) dopo 7- 14-21 giorni di coltura. Nei pannelli B, D, F, H sono rappresentati gli stessi campioni confrontati con il le cellule NT2 differenziate con Ra 1µM. T-student p<0,05; *: exp o Ra verso il ctr, ‡: Ra verso exp.

DISCUSSIONE

La linea cellulare AtT20 D16V è un modello di neurone peptidergico ed è interessante in quanto differenzia spontaneamente in vitro dopo 5 giorni di coltura. La maturazione è caratterizzata dalla formazione di lunghi processi neuritici con coni di accrescimento nei quali si accumulano granuli secretori contenenti ormone adrenocorticotropo (ACTH) (Tooze et al, 1989).

Queste cellule neuroendocrine sono elettricamente eccitabili ed esprimono canali del Ca2+

voltaggio dipendente. Dato che è stato dimostrato che il campo magnetico a frequenza estremamente bassa determina variazioni nella concentrazione del calcio intracellulare (Liboff 1985a,b; Blackman et al, 1985), il primo obiettivo è stato quello studiare l’effetto del campo di 50Hz, 2mT d’intensità sul flusso del calcio. Gli esperimenti sono stati effettuati marcando le cellule AtT20 con due sonde fluorescenti raziometriche che legano in maniera specifica lo ione calcio e lo ione H+ e sono rispettivamente indo1 e SNARF. Questi fluorofori, date le loro caratteristiche, mi ha permesso di monitorare in tempo reale i cambiamenti di [Ca2+] e di pH intracellulare in cellule esposte al campo magnetico. I dati ottenuti hanno mostrato che l’accensione del campo imposto, dopo 300s di registrazione del segnale, determina un aumento immediato della concentrazione del calcio intracellulare (Fig. 7.A), portandolo da un valore basale medio di 180nM a quello di 265nM (Fig. 7.B). Contemporaneamente è stata registrata una diminuzione nel valore del pH e questo è dovuto al rilascio di ioni idrogeno dai sistemi tampone intracellulari come il Mitocondrio (Fig. 7.C).

Lo ione calcio svolge un ruolo centrale nella biologia della cellula, ad esempio per quanto riguarda la polimerizzazione dell’actina o il differenziamento cellulare. Le AtT20 che differenziano verso il tipo neuronale subiscono un cambiamento morfologico e questo fenomeno risulta essere accelerato nelle cellule esposte al campo per 24 ore. Come si può

vedere nelle immagini acquisite al SEM, le AtT20 trattate hanno infatti una forma più poligonale e si possono vedere strutture filamentose simili ai neuriti che nelle cellule di controllo sono assenti (Fig. 8.B e A).

La marcatura del citoscheletro con la tossina falloidina, che lega in maniera specifica la forma filamentosa dell’actina, mi ha permesso di mettere in relazione i cambiamenti osservati nelle AtT20 esposte al campo ELF-EMF ad una riorganizzazione dell’actina a livello citoplasmatico. Se nelle cellule di controllo la microscopia confocale mostrava un accumulo di actina a livello della membrana plasmatica (Fig. 8.C), il campo magnetico di 50Hz, 2mT, determinava invece, dopo 24 ore, una riorganizzazione dei microfilamenti di actina che si presentavano distribuiti in maniera più uniforme a livello del citoplasma (Fig. 8.D).

Le cellule AtT20 sono, come abbiamo già accennato, un modello di cellula neuroendocrina ed esprimono, una volta differenziate, i tipici filamenti intermedi delle cellule neuronali, i neuroflilamenti. Le analisi effettuate con microscopia confocale e PCR semiquantitativa hanno mostrato che una esposizione di 24 ore al campo magnetico determinava nelle AtT20 un cospicuo aumento nella espressione della subunità di NF-H (Fig. 9.B e Fig. 10, colonna 2). Dato che i primi risultati ottenuti riguardavano la fluttuazione del calcio dovuta alla esposizione al campo magnetico, ho deciso di studiare il possibile coinvolgimento dei canali del calcio di tipo L (L-type Voltage gated calcium channels) sull’espressione di NF- H. A tal fine le cellule AtT20 sono state trattate con un antagonista dei canali L-type VGCC. La Nifedipina è stata usata alla concentrazione di 0,3µM ed è stata fornita prima dell’esposizione al campo ELF-EMF. Il farmaco ha determinato una forte diminuzione nell’espressione di NF-H che era stato invece up regolato dalla esposizione al campo per 24 ore (Fig. 9.D e Fig. 10, colonna 4). Questi risultati nel loro insieme sembrano supportare l’ipotesi che il principale target del campo magnetico in questo sistema siano gli L-type VGCC.

I risultati ottenuti dimostrano quindi che le cellule esposte assumono precocemente le caratteristiche dei neuroni peptidergici. Questo dato è stato supportato dalle analisi effettuate con microscopia confocale (Fig. 11) ed elettronica a trasmissione (Fig. 12) svolte al fine di studiare la presenza e l’accumulo di vescicole sinaptiche e granuli elettron- densi. Nelle cellule esposte al campo di 50Hz, 2mT per 48 ore si è osservata una maggiore

positività per la sinaptofisina, glicoproteina delle piccole vescicole sinaptiche (Fig. 11.B), rispetto ai controlli (Fig. 11.A) e questo marcatore era maggiormente accumulato a livello dei coni di crescita. L’analisi al TEM ha mostrato che le cellule AtT20 esposte al campo magnetico per 24 ore (Fig. 12.B) hanno un maggior numero di granuli secretori elettron- densi rispetto ai controlli (Fig. 12.A) e questi erano sopratutto accumulati a livello della membrana plasmatica e nella regione attorno al nucleo.

Per concludere i dati raccolti supportano l’ipotesi che l’esposizione delle cellule della linea cellulare AtT20 D16V per 24 ore ad un campo di 50Hz, 2mT sia in grado di indurre un precoce differenziamento neuronale. Questo effetto è stato valutato in termini di espressione di marker tipicamente neuronali che risultano essere espressi in seguito alla esposizione delle cellule al campo magnetico. Presumibilmente i cambiamenti nella fisiologia, morfologia, e biochimica cellulare sono dovuti al passaggio attraverso la membrana di calcio che in queste cellule avviene principalemente per apertura dei canali voltaggio dipendenti di tipo L.

Le cellule NT2 sono una linea ottenuta dal teratocarcinoma umano, sono quindi cellule di carcinoma embrionale (EC, embryonal carcinoma) considerate la controparte maligna delle cellule staminali embrionali (ES, embryonal stem). Quando vengono trattate in vitro con Acido Retinoico differenziano in diversi tipi cellulari tra i quali i neuroni post mitotici del sistema nervoso centrale.

I protocolli utilizzati inizialmente per il differenziamento delle NT2 non permettevano di ottenere elevate percentuali di neuroni ma l’introduzione della tecnica delle colture primarie insieme alla somministrazione del differenziante chimico (RA) permise di ottenere colture pure (>95%) di cellule neuronali (Pleasure et al, 1992). Tuttavia il differenziamento delle NT2 tramite questa tecnica richiedeva lunghi periodi di tempo (6 settimane). Il protocollo che ho utilizzato in questo lavoro di tesi è stato quello sviluppato da Cheung e colleghi (1999). Il metodo è detto di aggregazione cellulare ( in neurosfere) ed è stato dimostrato promuovere il differenziamento indotto da Acido Retinoico consentendo di ottenere neuroni da colture di NT2 in sole due settimane. Anche se l’aggregazione è in grado di indurre cambiamenti biochimici di tipo neuronale in presenza di basse concentrazioni di RA, di per sé non è comunque in grado di portare allo sviluppo del

fenotipo neuronale. Inoltre in nessun modo la coltura in forma di neurosfere può sostituire l’Acido Retinoico come fattore che da inizio al differenziamento.

In questa tesi sono mostrati i dati preliminari che riguardano gli effetti dell’esposizione della linea NT2 al campo magnetico ELF. Le cellule sono state poste in capsule petri a bassa adesione in modo tale che formassero aggregati cellulari, detti sfere, e trattati o con Acido Retinoico 1µM , o col campo magnetico di 29 Hz, 1 mT per 14 giorni. Nelle figure 13.A e B sono mostrati due campioni di controllo mantenuti in coltura per due settimane in forma di aggregati e poi piastrati su matrigel in presenza di AraC, che consente la crescita dei neuriti. Come si può osservare nelle immagini a contrasto di fase le cellule che derivano dalle sfere sono grandi, appiattite, con nuclei di forma irregolare con nucleoli prominenti ed assomigliano alle cellule della linea originale. Al contrario nelle figure 13.C e D si può osservare come dalle sfere che sono state esposte al campo magnetico per 14 giorni, fuoriescano, oltre a cellule del tutto simili a quelle mostrate in figura 13.A e B, cellule che sono in grado di formare lunghe strutture simil neuritiche totalmente assenti nei campioni di controllo. Il trattamento delle neurosfere con Acido Retinoico 1µM determina invece, come è ben visibile in figura 13.E ed F, la formazione di una fitta rete di neuriti che interconnettono i diversi elementi che hanno un caratteristico piccolo corpo cellulare. Se come precedentemente detto l’aggregazione cellulare non può sostituire l’agente chimico (RA) nell’indurre il differenziamento neuronale, i primi risultati che ho ottenuto con questo metodo mostrano invece come un agente fisico, quale il campo magnetico, possa essere invece un iniziatore di tale processo.

Il trattamento delle NT2 con Acido Retinoico risulta nell’upregolazione degli specifici fattori di trascrizione bHLH e di altri marcatori neuronali; questi eventi sono accompagnati dall’arresto delle cellule in fase G1 e dalla loro conseguente uscita dal ciclo cellulare come

dimostrato dall’aumento dei livelli d’espressione dell’inibitore della chinasi ciclica dipendente (CDK2) p27Kip1 (Andrews, 1984; Megiorni et al, 2005). In figura 14 sono riportati i dati riguardanti l’analisi del ciclo cellulare effettuato tramite marcatura con ioduro di propidio. Si può osservare come l’esposizione al campo magnetico di 29 Hz, 1 mT determini nelle NT2 una variazione delle percentuali delle cellule nelle fasi G2/M, S e

G1/G0 caratterizzate da un aumento a 7 giorni della fase S, rispetto al controllo, e a 14 e 21

Retinoico 1µM e questo risultato suggerisce, insieme ai dati precedentemente mostrati, che il campo ELF può essere in grado di agire come un differenziante fisico.

Se l’utilizzo della linea AtT20 mi ha permesso di studiare l’effetto del campo magnetico sulla maturazione dei neuroni peptidergici, l’impiego delle cellule NT2 mi ha invece consentito di spostare l’attenzione sulle fasi precoci del differenziamento neuronale. Come è già stato precedentemente spiegato i neuroni ottenuti dalla linea NTERA 2 sono cellule post mitotiche, con un fenotipo polarizzato che mantengono la plasticità dei neuroni immaturi in quanto rigenerano i neuriti in seguito a successivi piastramenti (Pleasure et al, 1992). Proprio perché non completamente mature, esprimono principalmente i marcatori neuronali precoci ed invece in minor percentuale i marcatori tardivi (vedi introduzione). Dato che il mio obiettivo è stato quello di studiare in maniera generale l’effetto dell’esposizione al campo magnetico ELF sul differenziamento neuronale, ho deciso di analizzare sia marcatori precoci, NeuroD e Nestina, che marcatori tardivi, NR1 e TAU. In letteratura è riportato che subito dopo l’induzione del differenziamento in vitro delle NT2 per mezzo dell’Acido Retinico si ha un picco d’espressione della Nestina, filamento intermedio espresso nelle cellule proliferanti neuronali, seguito da una sua graduale diminuzione. Quando i precursori neuronali committed iniziano a uscire dal ciclo cellulare si ha l’attivazione del gene per la proteina bHLH NeuroD con un picco di espressione al decimo giorno di trattamento con RA poi seguito da una graduale down regolazione nei tempi successivi (Megiorni et al, 2005). Il pattern d’espressione appena descritto corrisponde a quello ottenuto mediante analisi quantitativa in Real Time PCR e presentato nelle figure 15.B e D (barre bianche). Negli stessi pannelli sono stati rappresentati, oltre ai campioni trattati con RA, i dati relativi ai campioni esposti al campo magnetico ELF, mostrati poi in maggior dettaglio in figura 15. A e C. Si può osservare come il campo di 29 Hz, 1 mT determini a 7-14-21 giorni, rispetto ai controlli, un aumento statisticamente significativo dell’espressione dei due marcatori Nestina e NeuroD e come l’andamento della Nestina sia molto simile a quello dei campioni trattati con Acido Retinoico (Fig. 15.D). Questo è valido fino a due settimane in quanto dopo 21 giorni di esposizione a 29 Hz, 1 mT i valori della Nestina appaiono maggiori di quelli dei trattati con RA come ad indicare un differenziamento più graduale. Al contrario in figura 15.B si osserva come nei campioni esposti al campo magnetico ELF ci sia un progressivo aumento a 7-14-21 giorni

dell’espressione di NeuroD in maniera apparentemente differente dai campioni in Acido Retinoico. In realtà i dati portano ad ipotizzare che nei campioni esposti non sia ancora stato raggiunto un picco d’espressione che è stato invece da noi riscontrato a 7 giorni nei campioni trattati con il differenziante chimico. Questi risultati lasciano pensare che l’esposizione ad un campo magnetico ELF sia in grado di indurre il differenziamento neuronale nelle NT2 espletando la sua azione in maniera più lenta ma continuativa rispetto all’Acido Retinoico che svolge invece il suo effetto legandosi a recettori specifici.

L’espressione dei marcatori tardivi NR1 e TAU nelle cellule trattate con RA corrisponde all’andamento riportato in letteratura (Andrews, 1984; Pleasure et al, 1992). Come atteso, il campo magnetico, figura 15.F e H, determina un aumento graduale dell’espressione dei geni per NR1 e TAU, con valori statisticamente maggiori rispetto ai controlli (Fig. 15.E e G) seguendo un pattern del tutto simile a quello osservato nelle NT2 in Acido Retinoico. Per concludere i dati preliminari di questa tesi di dottorato mostrano come un agente fisico come quello da noi utilizzato possa essere in grado di indirizzare le cellule di teratocarcinoma umano NT2 verso il differenziamento neuronale in maniera alternativa al trattamento con l’Acido Retinoico. Il mio prossimo obiettivo sarà proprio quello di investigare le possibili vie e cascate del segnale attivate dall’interazione tra il campo di 29 Hz, 1 mT e le cellule NT2 ponendo particolare attenzione sul ruolo del Ca2+ come secondo messaggero durante il differenziamento.

REFERENZE

Adey WR.Biological effects of electromagnetic fields. J Cell Biochem. 1993 Apr;51(4):410-6.

Andrews PW. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Dev Biol. 1984 Jun;103(2):285-93.

Andrews PW. Human teratocarcinomas. Biochim. Biophys. Acta 1988; 948: 17-36. Andrews PW. From teratocarcinomas to embryonic stem cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2002 Apr 29;357(1420):405-17.

Andrews PW, Casper J, Damjanov I, Duggan-Keen M, Giwercman A, Hata J, von Keitz A, Looijenga LH, Millán JL, Oosterhuis JW, Pera M, Sawada M, Schmoll HJ,Skakkebaek NE, van Putten W, Stern P. Comparative analysis of cell surface antigens expressed by cell lines derived from human germ cell tumours. Int J Cancer. 1996 Jun 11;66(6):806-16. Andrews PW, Damjanov I, Simon D, Banting GS, Carlin C, Dracopoli NC, Føgh J. Pluripotent embryonal carcinoma clones derived from the human teratocarcinoma cell line Tera-2. Differentiation in vivo and in vitro. Lab Invest. 1984 Feb;50(2):147-62.

Andrews PW, Gönczöl E, Plotkin SA, Dignazio M, Oosterhuis JW. Differentiation of TERA-2 human embryonal carcinoma cells into neurons and HCMV permissive cells. Induction by agents other than retinoic acid. Differentiation. 1986 ;531(2):119-26.

Andrews PW, Matin MM, Bahrami AR, Damjanov I, Gokhale P, Draper JS.Embryonic stem (ES) cells and embryonal carcinoma (EC) cells: opposite sides of the same coin. Biochem Soc Trans. 2005 Dec;33(Pt 6):1526-30.

Baker KA, Hong M, Sadi D, Mendez I. Intrastriatal and intranigral grafting of hNT neurons in the 6-OHDA rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 2000 Apr;162(2):350-60.

Barnes PS. Effect of electromagnetic field on the rate of chemical reactions. Biophysics 1996, 41:801-808.

Bellomo G, Mirabelli F, Vairetti M, Iosi F, Malorni W. Cytoskeleton as a target in menadione-induced oxidative stress in cultured mammalian cells. I. Biochemical and immunocytochemical features. J Cell Physiol. 1990 Apr;143(1):118-28.

Berridge MJ, Bootman MD, Roderick HL. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Jul;4(7):517-29.

Betti E, Marchetti S, Cadossi R, Faldini A. Effect of electromagnetic field stimulation on fractures of the femoral neck. A prospective randomized double-blind study. In Second World Congress for Electricity and Magnetism and in Biology and Medicine. Bologna June 8-13, 1997.

Blackman CF, Benane SG, House DE, Joines WT. Effects of ELF (1-120Hz) and modulated (50Hz) RF fields on the efflux of calcium ions from brain tissue in vitro. Bioelectromagnetics 1985, 6:1-11.

Blackman CF, Benane SG, House DE. Frequency-dependent interference by magnetic fields of nerve growth factor-induced neurite outgrowth in PC-12 cells. Bioelectromagnetics. 1995;16(6):387-95.

Blackman CF, Blanchard JP, Benane SG, House DE. Empirical test of an ion parametric resonance model for magnetic field interactions with PC-12 cells. Bioelectromagnetics 1994, 15:239-260.

Buonassisi V, Sato G, Cohen AI. Hormone-producing cultures of adrenal and pituitary tumor origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1962 Jul 15;48:1184-90.

Cadossi R, Bersani F, Cossarizza A, Zucchini P, Emilia G, Torelli G, Franceschi C. Lymphocytes and low-frequency electromagnetic fields. FASEB J 1992, 6:2667-2674. Cameron HA, McKay RD. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus.J Comp Neurol. 2001 Jul 9;435(4):406-17.

Cameron P, Mundigl O, De Camilli P. Traffic of synaptic vesicle proteins in polarized and nonpolarized cells.J Cell Sci Suppl. 1993;17:93-100.

Casella C, Taglietti V. Principi di Fisiologia. vol II. 1996. La goliardica Pavese s.r.l. Pavia.

Catterall WA.Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 2000;16:521-55.

Chang WH, Chen LT, Sun JS, Lin FH: Effect of pulse-burst electromagnetic field stimulation on osteoblast cell activities. Bioelectromagnetics 2004, 25:457-465.

Cheung WM, Fu WY, Hui WS, Ip NY. Production of human CNS neurons from embryonal carcinoma cells using a cell aggregation method. Biotechniques. 1999 May;26(5):946-8, 950-2, 954.

Cossarizza A, Monti D, Bersani F, Cantini M, Cadossi R, Sacchi A, Franceschi C. Extremely low frequency pulsed electromagnetic fields increase cell proliferation in lymphocytes from young and aged subjects. Biochem Biophysical Res Commun 1989, 160:692-698.

Dahlstrand J, Lardelli M, Lendahl U. Nestin mRNA expression correlates with the central nervous system progenitor cell state in many, but not all, regions of developing central nervous system. Brain Res Dev Brain Res. 1995 Jan 14;84(1):109-29.

Darzynkiewicz Z: Nucleic Acid Analysis. In Current Protocols in Cytometry. Chapter 7. Edited by Robinson JP. New York: Wiley & Sons; Inc, 1997.

Dehmelt L, Halpain S.The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome Biol. 2005;6(1):204.

Dingledine R, Boland LM, Chamberlin NL, Kawasaki K, Kleckner NW, Traynelis, SF and Verdoorn TA. Amino acid receptors and uptake systems in the mammalian central nervous system. CRC Crit. Rev. Neurobiol. 1988; 4, 1-96.

Draper JS, Pigott C, Thomson JA, Andrews PW.Surface antigens of human embryonic stem cells: changes upon differentiation in culture. J Anat. 2002 Mar;200(Pt 3):249-58. Dubinsky JM, Oxford GS. Ionic currents in two strains of rat anterior pituitary tumor cells. J Gen Physiol. 1984 Mar;83(3):309-39.

Dunnett SB, Kendall AL, Watts C, Torres EM. Neuronal cell transplantation for Parkinson's and Huntington's diseases. Br Med Bull. 1997;53(4):757-76.

Erices AA, Allers CI, Conget PA, Rojas CV, Minguell JJ.Human cord blood-derived mesenchymal stem cells home and survive in the marrow of immunodeficient mice after systemic infusion. Cell Transplant. 2003;12(6):555-61.

Ernst C, Christie BR. Nestin-expressing cells and their relationship to mitotically active cells in the subventricular zones of the adult rat. Eur J Neurosci. 2005 Dec;22(12):3059-66. Ertel EA, Campbell KP, Harpold MM, Hofmann F, Mori Y, Perez-Reyes E, Schwartz A, Snutch TP, Tanabe T, Birnbaumer L, Tsien RW, Catterall WA. Nomenclature of voltage- gated calcium channels. Neuron. 2000 Mar;25(3):533-5.

Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.Nature. 1981 Jul 9;292(5819):154-6.

Feria-Velasco A, Castillo-Medina S, Verdugo-Díaz L, Castellanos E, Orozco-Suárez S, Sánchez-Gómez C, Drucker-Colín R.Neuronal differentiation of chromaffin cells in vitro, induced by extremely low frequency magnetic fields or nerve growth factor: a histological and ultrastructural comparative study. J Neurosci Res. 1998 Sep 1;53(5):569-82.

Fogh J, Trempe G. (1975) in Human Tumor Cell Lines in Vitro, ed Fogh J. (Plenum Press, New York), pp 115–169.

Freed CR, Greene PE, Breeze RE, Tsai WY, DuMouchel W, Kao R, Dillon S, Winfield H,