Angiogenesi nelle cellule endoteliali dopo stimolazione con EPOα, DarbEPO e CERA: saggio in vitro

Per determinare se i derivati ESA avessero influenza sulla potenzialità angiogenica delle cellule endoteliali, è stato eseguito il saggio su Matrigel ed è stata valutata la capacità delle HUVEC di formare una rete di maglie simile alla struttura di un capillare. Questo è un metodo comunemente utilizzato per la valutazione in vitro dell’angiogenesi. Le HUVEC sono state trattate per 24 ore con EPOα (1 UI/ml), DarbEPO (1 UI/ml), CERA (5 UI/ml) e con l’inibitore della fosforilazione di STAT-5, NT (80 M). Dopodiché le cellule sono state seminate su Matrigel in piastre da 24 pozzetti con mezzo fresco. E’ stata valutata la formazione della rete simil-capillare e le foto sono state scattate dopo 20 ore di

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incubazione su Matrigel (Figura 24A). L'analisi quantitativa ha rilevato che il numero di strutture simili a maglie, a seguito del trattamento con i tre ESA, era significativamente superiore rispetto al controllo non trattato (Figura 24B, EPOα 148,4 ± 26,8, p <0,05; DarbEPO 163,1 ± 35.3, p <0.01; CERA 170,8 ± 26.3, p <0.001 rispetto al valore basale). Questi dati suggeriscono che EPOα, DarbEPO e CERA promuovono l'angiogenesi delle HUVEC in vitro. Tuttavia, l’inibitore della fosforilazione di STAT-5, NT, induce un significativo effetto inibitorio sulla formazione delle strutture simil-capillari anche da solo, perciò non è adatto in queste condizioni sperimentali per verificare il coinvolgimento di STAT-5 nell’attività proangiogenica mediata dagli ESA.

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Figura 24: Effetto degli ESA sull'angiogenesi nelle HUVEC. Le cellule sono state trattate

con solo veicolo nel controllo (basale) e con EPOα (1 UI/ml), DarbEPO (1 UI/ml), CERA (5 UI/ml) per 24 ore prima della semina su Matrigel con mezzo fresco. La formazione del tubulo-simil capillare è stata osservata al microscopio e quantificata utilizzando il programma ImageJ. (A) Immagine rappresentativa della formazione di reti di maglie nelle HUVEC su Matrigel dopo 24 ore di incubazione farmaco. (a) basale; (b) inibitore STAT-5; (c) EPOα (1 UI/ml); (d) DarbEPO (1 UI/ml); (e) CERA (5 UI/ml) (Ingrandimento originale = 10 ×). (B) Il numero di strutture simili a maglie è stato quantificato ed espresso come percentuale rispetto al campione di controllo. I dati sono espressi come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti condotti in duplicato. *** p <0,001; ** p <0.01; * p <0.05 vs valore basale.

3.8 Conclusioni

L'equilibrio tra i benefici e i rischi nell'uso delle epoetine probabilmente dipende da diversi fattori, tra i quali la dose di farmaco efficace, la durata del trattamento farmacologico, la farmacocinetica e la risposta funzionale degli EPO-R endoteliali nel tempo. Questi parametri potrebbero spiegare le differenze di efficacia e di altri effetti terapeutici presenti tra i diversi ESA. In questo studio è stato evidenziato che i tre agonisti EPO-R, che presentano strutture diverse (DarbEPO, EPOα e CERA), regolano la risposta funzionale del recettore stesso nel tempo in modi diversi. In particolare, è stato dimostrato che EPOα, DarbEPO e CERA desensitizzano il recettore per l’eritropoietina e presentano differenze marcate nella sua cinetica di risensitizzazione, un processo critico di ripristino della risposta funzionale del recettore sulla membrana.

In primo luogo è stato osservato il meccanismo con cui EPOα, DarbEPO e CERA attivano il segnale di EPO-R nelle HUVEC. Tutti gli agonisti stimolano la fosforilazione di STAT-5 in modo dipendente dalla concentrazione e con cinetiche diverse. Sia EPOα che DarbEPO mostrano un’attivazione monofasica del fattore di trascrizione con un picco massimo alla concentrazione di 1 UI/ml per entrambe le epoetine. CERA, invece, induce un'attivazione marcata della fosforilazione di STAT-5, con una cinetica bifasica e un picco massimo corrispondente alla concentrazione di 5 UI/ml. Questi risultati mostrano un meccanismo di azione diverso per DarbEPO e CERA a livello recettoriale.

Sono stati eseguiti saggi di vitalità e di angiogenesi per valutare se la via intracellulare che vede coinvolto STAT-5, dopo attivazione con i diversi ESA, potesse avere un ruolo

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funzionale nelle cellule endoteliali. E’ stato dimostrato che EPOα induce un aumento significativo della vitalità cellulare attraverso un meccanismo che coinvolge l’attivazione di STAT-5; anche DarbEPO ha rivelato effetti simili, mentre CERA non ha indotto alcuna variazione significativa sulla vitalità cellulare. L'incapacità di CERA di modulare la vitalità cellulare dopo un lungo periodo di incubazione del farmaco stesso con le HUVEC (72 ore) potrebbe essere causata da un distinto meccanismo molecolare di interazione di questo derivato a livello recettoriale rispetto agli altri ESA e dal coinvolgimento di vie intracellulari diverse (da quella che vede coinvolta STAT-5) nella regolazione della sopravvivenza.

Con il test in vitro dell’angiogenesi sono state esaminate le diverse epoetine nella formazione della rete vascolare su Matrigel. L’incubazione delle HUVEC con EPOα, DarbEPO e CERA ha indotto un significativo aumento del numero di strutture simil- capillare, un valido parametro topologico di angiogenesi, suggerendo che questi composti hanno effetti pro-angiogenici sulle cellule endoteliali. Tuttavia, poiché l’inibitore della fosforilazione di STAT-5 ha mostrato anche da solo un effetto inibitorio sul rimodellamento delle cellule endoteliali, non è stato possibile dimostrare il coinvolgimento di questa via intracellulare negli effetti mediati dagli ESA nell’angiogenesi. In secondo luogo è stato studiato il meccanismo di desensitizzazione di EPO-R in seguito a prolungata esposizione delle cellule a EPOα, DarbEPO e CERA. Non è stata osservata nessuna significativa differenza nella cinetica di desensitizzazione indotta da EPOα e DarbEPO , suggerendo che questi due agonisti agiscano con meccanismi simili. D’altro canto, CERA causa una desensitizzazione più rapida rispetto agli altri ESA. Queste differenze possono essere spiegate assumendo che i diversi derivati ESA attuino distinti meccanismi molecolari a livello del recettore. Rispetto a EPOα, CERA ha una minore affinità per il recettore e si dissocia in modo più rapido. L’inferiore affinità recettoriale potrebbe giustificare la necessità di una maggiore concentrazione CERA per ottenere la massima attivazione di segnale intracellulare. Inoltre, la rapida cinetica associazione/dissociazione di CERA potrebbe essere la causa della rapida induzione di desensitizzazione di EPO-R.

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E’ stato poi valutato il meccanismo con cui la rimozione dell’agonista, dopo desensitizzazione del recettore per l’EPO, potesse ripristinare la funzione del recettore. Tra i meccanismi regolatori che controllano la funzionalità dei recettori della membrana plasmatica, la risensitizzazione è un evento chiave nel garantire il recupero di recettori di membrana allo stato attivo e nel consentire a questi di rispondere a stimoli successivi. Sono state osservate cinetiche di risensitizzazione diverse dopo esposizione delle cellule a EPOα e DarbEPO: quando la desensitizzazione dei recettori è stata indotta per un periodo di tempo più breve (18 minuti), il recupero della risposta recettoriale è stato osservato dopo 2 ore di wash-out. Al contrario, quando la desensitizzazione del recettore è stata indotta per un periodo di tempo più lungo (54 minuti), la risensitizzazione del recettore è stato rilevata solo dopo 24 ore di wash-out. Questi risultati mostrano che il tempo di esposizione e, in misura minore, la concentrazione di agonista, sono fattori importanti per la regolazione della risensitizzazione. Quando DarbEPO è stato utilizzato negli esperimenti di desensitizzazione /risensitizzazione, il recupero della risposta funzionale si è verificato con una cinetica molto più lenta. A basse dosi di DarbEPO e con tempi di desensitizzazione brevi, la risensitizzazione significativa di EPO-R si è verificata dopo 6 ore di wash-out. Aumentando la concentrazione di DarbEPO a 3 UI/ml e il periodo di desensitizzazione a 54 minuti, la reattività di EPO-R sembra essere completamente assente anche dopo 24 ore di wash-out. Quando CERA è stato utilizzato in questi stessi esperimenti, il recupero di reattività del recettore, a pari tempi di desensitizzazione, è stato più veloce rispetto a EPOα. Presi insieme questi risultati suggeriscono che EPOα, DarbEPO e CERA influiscono in modo diverso sul meccanismo intracellulare coinvolto nel riciclo di EPO-R sulla membrana plasmatica. È probabile che le differenze strutturali delle molecole possano influenzare il traffico intracellulare dei recettori e possano cambiare la permanenza dei recettori attivati sulla superficie cellulare.

Per determinare se questi ESA potessero influenzare il turnover di EPO-R a livello di regolazione della sintesi proteica, è stato valutato l'effetto di desensitizzazione/ resensitizzazione dei recettori, indotte dalle tre epoetine, sull'espressione di EPO-R tramite l’utilizzo di Real Time-PCR. E’ stato dimostrato che EPO-R, dopo desensitizzazione indotta da EPOα, DarbEPO e CERA, è rapidamente inibito in quanto scarsamente espresso. Dopo trattamento con EPOα e CERA, il recettore viene risensitizzato e questo

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processo vede coinvolta la sintesi di un pool di nuove proteine recettoriali. Viceversa, in seguito a trattamento con DarbEPO, il turnover fisiologico di EPO-R sembra essere compromesso. In questo caso non vi è alcuna nuova sintesi del recettore in quanto i livelli della proteina sono rimasti bassi e EPO-R non è in grado di riciclare sulla membrana plasmatica in uno stato attivo funzionale.

Sulla base di questi dati, si può ipotizzare che la desensitizzazione reversibile di EPO-R, oltre alla funzione di spegnere una risposta biologica, potrebbe attivare un segnale a lungo termine di controllo sull’espressione del recettore a livello nucleare. Differenze nella struttura chimica delle epoetine probabilmente influiscono sulla macchina endocitica di EPO-R e possono controllare in modo differenziale il turnover dell’EPOR, importante per la conseguente funzionalità del recettore.

Questi dati supportano l'ipotesi che l'attivazione di EPO-R a basse dosi di ESA, per un breve periodo di tempo, è un prerequisito essenziale per mantenere il recettore in uno stato funzionale nelle cellule endoteliali. Questi risultati possono rappresentare un importante punto di partenza per la creazione di nuovi protocolli terapeutici per l’EPO e suoi derivati nel trattamento di lesioni vascolari. Anche se può essere difficile tradurre i dati in un modello in vivo, lo studio dei meccanismi di regolazione di EPO-R nelle cellule endoteliali rappresenta un punto di partenza per l’analisi della capacità di risposta funzionale del recettore stesso e per l'ottimizzazione individuale di una terapia efficace. Sebbene la disponibilità di farmaci a lunga durata sia clinicamente utile in termini di costo e di numero di somministrazioni, deve essere notato che la scelta dei differenti ESA e l'uso di alte dosi di questi farmaci possono influenzare il turnover fisiologico del recettore e causare l'insorgenza di resistenza ai farmaci, con conseguente aumento della dose per ottenere simili effetti farmacologici.

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