Nicla Romano, Giuseppina Ceccarelli, Maria Rosaria Baldassini, Cecilia Caprera, Giovanna Marino*, Jan H.M.W. Rombout**, Lucia Mastrolia e Luigi Abelli***
Dipartimento di Scienze Ambientali, Università della Tuscia, Viterbo, Italia; (*) Istituto di Ricerca Applicata al Mare, Roma;(**) Dipartimento di Scienze Animali, Università dell’Agricoltura di Wageningen, Wageningen, Olanda;(***) Dipartimento di Biologia e dell’Evoluzione, Sezione di Anatomia Comparata, Università di Ferrara, Ferrara, Italia.
RIASSUNTO
Il timo dei pesci svolge un ruolo importante nel corretto sviluppo del sistema immunitario. In questo studio è stata indagata nel timo la presenza e la distribuzione delle cellule apoptotiche durante lo sviluppo del timo in differenti specie di pesci, mediante la tecnica della marcatura terminale in situ del DNA frammentato. Nella carpa (Cyprinus carpio), sono stati confermati i dati già esistenti durante lo sviluppo (Romano et al., 1999b) ed in seguito sono stati ulteriormente ampliati. Durante la 1° settimana post schiusa (p.s.), 3 giorni dopo la comparsa dell’abbozzo timico, le cellule apoptotiche appaiono diffuse nel parenchima. Dalla 1° alla 4° settimana p.s. il numero di queste cellule aumenta e risultano essere principalmente localizzate nella regione più esterna del timo. Dalla 4° fino alla 30°-40° settimana p.s. la misura del diametro dei linfociti non apoptotici varia seguendo la formazione del cortex e della medulla. Dalla 22° settimana p.s. le cellule apoptotiche diventano molto più numerose nel cortex che nella medulla e si comincia ad osservare un leggero aumento della densità di queste cellule al confine cortico-medullare. Nel timo di età tardo-giovanile (500 giorni p.s.) il numero delle cellule apoptotiche diminuisce, rimanendo localizzate preferenzialmente nel cortex. Nei pesci Teleostei Perciformi la distribuzione delle cellule apoptotiche è risultata simile a quella della carpa: i) nella spigola (D. labrax), in accordo con precedenti studi (Abelli et al., 1998), le prime cellule apoptotiche compaiono intorno al 35° giorno p.s.; ulteriori analisi hanno indicato un particolare ruolo delle regioni corticali e cortico-medullari. Infatti durante lo sviluppo le cellule apoptotiche dalla porzione più esterna del timo si localizzano anche più centralmente, nel bordo cortico-medullare (a 70 giorni p.s) e raramente nella medulla. Dal 165° giorno p.s. e nei pesci tardo-giovanili, il numero delle cellule apoptotiche diminuisce nel bordo cortico-medullare e rimane confinato prevalentemente nel cortex; ii) nella cernia (Epinephelus marginatus) il primo abbozzo timico appare al 15° giorno p.s., mentre le cellule apoptotiche cominciano ad apparire 48° giorno p.s. Durante tutto lo sviluppo del timo si osserva un incremento del numero di tali cellule soprattutto nel cortex e contemporaneamente decresce il valore medio dei diametri di tali cellule. Negli individui giovanili e tardo-giovanili le apoptosi rimangono più numerose nella regione corticale; iii) nei pesci antartici (timo adulto), dove il timo è estremamente adattato alle basse temperature (elevata vascolarizzazione e stroma fortemente compattato) le apoptosi sono molto più numerose (4-7 volte) rispetto a quelle delle specie di acque temperate e risultano distribuite principalmente nel cortex.
Nell’insieme questi dati suggeriscono che nel timo ci sia un comune processo di selezione negativa durante l’ontogenesi, che risulta principalmente ristretto al cortex e al bordo cortico- medullare. Anche nel pesce adulto il processo di selezione sembra essere attivo, ma confinato principalmente nella regione corticale.
INTRODUZIONE
I Teleostei rappresentano un gruppo eterogeneo di Vertebrati con appropriate caratteristiche di adattamento a differenti ambienti acquatici. Lo studio del sistema immunitario di questi organismi è motivo di interesse per i biotecnologi al fine di programmare ed ottimizzare specifici cicli di vaccinazione e per le analisi filogenetiche (Manning, 1994). Il sistema immunitario dei Teleostei ha molti aspetti di base in comune con quello dei Vertebrati, come la divisione in immunità specifica e non-specifica e la presenza di tessuti linfoidi e di cellule immunitarie come linfociti, macrofagi e granulociti (Ellis, 1997). Tra i tessuti linfoidi, il timo gioca un ruolo importante nella differenziazione dei linfociti T (Romano et al., 1999b, 2007; Picchietti et al., 2008). Nello sviluppo del timo dei pesci, come in quello dei mammiferi, sono attivi processi di selezione cellulare volti ad eliminare cellule in eccesso e cellule potenzialmente pericolose, come i linfociti autoreattivi (Abelli et al. 1998). A tal fine, come osservato nei mammiferi (Hengatner, 2000), e recentemente, nei vertebrati inferiori (Ottavini et al., 1997; Malikova et al., 2007), l’organismo ha messo a punto un efficace programma molecolare di morte cellulare (apoptosi) in cui l’attivazione delle caspasi è risultata essere l’esecutore centrale. L’attivazione delle caspasi non implica la degradazione della totalità delle proteine cellulari (Hengartner, 2000), piuttosto queste vanno a tagliare, in maniera selettiva, determinate proteine bersaglio solitamente in una o più posizioni della loro sequenza primaria. Una di queste proteine sembra attivare la nucleasi responsabile della frammentazione del DNA. Wyllie (1980) descrisse per la prima volta l’azione di questa nucleasi che taglia il DNA genomico in nucleosomi generando frammenti di 180-200 paia di basi o multipli. La presenza di questi frammenti di DNA è stata ampiamente utilizzata come indicatore della presenza di fenomeni di apoptosi (Hengartner, 2000). In generale i fenomeni apoptotici, alla base della selezione dei linfociti, possono essere indotti da traumi meccanici, chimico-fisici e patologici. Nei pesci, uno dei fattori maggiormente in grado di indurre apoptosi nelle cellule del timo, è la temperatura, probabilmente a causa della posizione
superficiale dell’organo stesso. I timociti rispondono al danno genomico, dovuto ad uno stress da temperatura, attraverso una complessa cascata di attivazioni, che include: l’arresto del ciclo cellulare, l’attivazione trascrizionale e post-trascrizionale di una serie di geni fra cui anche quelli coinvolti nella riparazione del DNA e, in alcune circostanze, l’innesco del programma di morte cellulare. Di conseguenza, i pesci Teleostei hanno evoluto dei meccanismi di controllo per limitare i danni da stress termico, come ad esempio la produzione delle proteine dello shock termico (Samali e Orrenius, 1998; Garrido et al., 2001; Sreedhar e Csermely, 2004; Beere, 2005; Kim et al., 2006; Didelot et al., 2006).
I pesci antartici vivono nelle acque polari, un ambiente estremo in cui la temperatura oscilla tra 1 e -2°C, i loro tessuti sono protetti dal rischio di congelamento grazie alle elevate concentrazioni di ioni nei fluidi corporei (Eastman e De Vries, 1996) e alla presenza di sostanze circolanti anti-congelamento prodotte dal fegato (Chen et al., 1997). Dal momento che i pesci antartici sono adattati allo stress esercitato dalle basse temperature, potrebbe essere interessante valutare l’andamento del numero delle cellule apoptotiche nel timo.
Il presente studio ha quindi lo scopo di effettuare uno studio generale sull’andamento dell’apoptosi durante lo sviluppo del timo comparando fra di loro organismi appartenenti a diversi ordini (Perciformi e Cipriniformi) e organismi adattati a vivere a diverse temperature (pesci di acque temperate e pesci antartici).