III MATERIALI E METOD
ID IRMM CRMs
5 Applicazione della tecnologia xMAP per la quantificazione di Cry1Ab 1 Saggio immunoenzimatico
Questo studio ha evidenziato come l'uso dei saggi immunoenzimatici possa essere alla base di nuove applicazioni in campo biotecnologico, in particolare qui applicato al controllo degli organismi geneticamente modificati. Il sistema Luminex proposto puo` essere utilizzato con piastre da 96, come in questo lavoro, o da 384-pozzetti, oltre alla possibilità di analizzarne simultaneamente quattro piastre con la versione dello strumento piu` avanzata HTS al posto del modello base Luminex-100 da noi utilizzato. Con la versione HTS, acronimo di High Through put System, lo strumento Luminex offre la possibilita` di automatizzare il saggio e renderlo adatto all’analisi di centinaina di campioni simultaneamente. Con la versione Luminex-100 l'analisi dei campioni su piastra da 96-pozzetti è completa in circa due ore, cinquanta minuti per la preparazione
del costo del saggio è direttamente collegata al numero di target inclusi nel saggio stesso. Per singola analisi il costo è comparabile a quello di una RT-PCR o di un ELISA test (uno e due Euro, rispettivamente) ma nel caso di rilevazioni simultanee multiple i costi per campione vengono ridotti proporzionalmente. In generale, la possibilita` di monitorare piu` target contemporaneamente fornisce una visione piu` completa e piu` approfondita del campione, rendendo i test immunoenzimatici ancor più attraenti. Si pensi per esempio all'avvento degli OGM di seconda generazione contenenti transgeni multipli. Il monitoraggio anche di questi nuovi prodotti biotecnologici ci spinge a sviluppare nuovi approcci metodologici che ci cosentano di compiere le analisi in modo efficace, esaustivo ed economicamente accettabile. L’informazione e la sicurezza sono due argomenti chiave nella politica della Commissione europea a difesa dei consumatori. Pertanto, l’identificazione e tracciabilità degli OGM sia nei foraggi che nei cibi dovra` essere assicurata e cio` sara` fattibile solo con sistemi di analisi che consentano il monitoraggio di molteplici “contaminazioni” simultaneamente sia in campioni grezzi che in prodotti alimentari e foraggi finiti. A tale riguardo, la prima applicazione della piattaforma immunologica Luminex-100 utilizzata per l’analisi quantitativa di una proteina OGM dimostra come i tradizionali saggi enzimatici potrebbero evolversi (Ermolli, 2006). In particolare, il saggio qui ottimizzato e` stato calibrato in modo da raggiungere valori di LOD e LOQ tali da permettere la rilevazione e la quantificazione di contaminazioni intorno allo 0.1%, in linea con i convenzionali test ELISA. Purtroppo, a causa della mancanza di anticorpi commercialmente disponibili, non è stato possibile sfruttare completamente la capacita` di analisi multipla del sistema. Nel manoscritto pubblicato, abbiamo potuto riportare soltanto la quantificazione singola di Cry1Ab. Dai risultati possiamo pero` evincere che il sistema è lineare ed ha prestazioni ottimali tra valori di percentuali di OGM tra lo 0% e il 3%: cio` risulta particolarmente utile per valutare livelli di contaminazione intorno allo 0.9% (soglia di legge sopra alla quale scatta l’obbligo di etichettatura). Questo risultato è paragonabile alle prestazioni dei kit commerciali ELISA e dell’ELISA Reverse per il quale, usando gli stessi anticorpi, la linearità è stata realizzata all'interno del range di valori tra lo 0% e il 2% (Ermolli, 2006;
conferma che il sistema è paragonabile all’ER e all’ELISA tradizionale. In particolare, l’accuratezza ed i valori di RDS sono tra l’81.5 e il 108.6% e di 1.9-10.8% (tranne punto D1<LOD), rispettivamente, in accordo con i valori dell’ER e dell’ELISA, dove l'accuratezza ha valori tra l’86.52 e il 113.47%; mentre l’RSD da 2.05 a 14.17% (Ermolli, 2006). I kit commerciali ELISA hanno, in generale, valori di accuratezza inferiori, cioe` nella gamma di 52.9-266.4% e RDS da 7.6% a 16.1% (Ermolli, 2006). I valori di LOD e di LOQ del test xMAP risultano inoltre paragonabili ai valori di LOD e di LOQ dell’ ER. Effettivamente, LOD e LOQ dell’ER sono uguali a 0.0056% ed a 0.0168%, rispettivamente, mentre LOD del test basato sull’xMAP Tech., calcolato usando tre materiali differenti (la proteina purificata, diluzioni dell'estratto della proteina MON810 di 100% e di CRMS) e` di 0.764 pg/mL, 0.018% (0.357 pg/mL) e 0.056% (~ 0.751 pg/mL), rispettivamente; mentre il valore migliore di LOQ è stato realizzato usando CRMS ed è di 0.054% (~ 1.072 pg/mL) (Ermolli, 2006). LOD e LOQ dei kit commerciali ELISA sono di 0.034-0.107% e di 0.082-0.259%, rispettivamente (Ermolli, 2006). In conclusione, il potenziale del sistema qui descritto pare in grado di compiere un'analisi multipla all'interno della stessa preparazione di campione con valori di sensibilià ed accuratezza adeguati. Anche nel settore agro-alimentare, selezionando un pannello di anticorpi differenti ognuno dei quali legato a un set di microsfere fluorescenti, sarebbe possibile la quantificazione di parecchi target simultaneamente come già dimostrato in altri campi d'applicazione (ISO 21572:2002; ISO 5725:1994; IUPAC, 2007, Carson, 1999; Seideman, 2002; Martins, 2002; Yang, 2001; Ye, 2001).
5.2 Saggio per acidi nucleici
Il saggio multiplo per la messa in evidenza delle sequenze specifiche di epsps e p35S mediante l’applicazione della Tecnologia xMap si e` rivelato all’altezza delle aspettative, ovvero versatile e sensibile come atteso. L’estrazione del DNAg e l’amplificazione dei due target non ha presentato nessun problema specifico. Il disegno delle sonde e degli inneschi e` stato realizzato sulla base della sequenza riportata in figura 30 con l’ausilio di un software commerciale (Premier Primer 4) con il quale si e` verificata l’assenza di falsi
testare il grado di sensibilità del metodo definendo i parametri di LOD e LOQ, rispettivamente pari a 45.1 (MFI) e 135.4 (MFI).
In particolare, per p35S e` stato possibile diluire l’anti-sonda fino a 0.78125 femtomoli ed ottenere ancora un segnale rilevabile con un valore di RSDr di soli 2.8. A tale diluizione si registra di contro una perdita di riproducibilità del saggio nel tempo. Cio` probabilmente e` indice di instabilita` dei reagiti a livelli cosi` spinti di diluizione. I valori di RSDR per gli ultimi tre livelli di diluizione testati non sono infatti piu` accettabili,
risultatando di 35, 57 e 64% rispettivamente. Pertanto l’ultima diluizione con un valore di RSDr e RSDR accettabile e` di 6,25 nmoli. Tale quantita` di target e` generalmente
considerata presente in un solo microlitro di prodotto di amplificazione con una buona efficienza di reazione, considerando che nel saggio e` possibile aumentare la quantita` di prodotto di reazione da testare fino a 17 microlitri, pare evidente che il metodo e` sufficientemente sensibile allo scopo.
L’efficienza di amplificazione e` ovviamente un punto cruciale per la riuscita del saggio, ma non determinante. Cio` e` dimostrato chiaramente da epsps dove si e` riscontrata un’efficienza di amplificazione molto piu` bassa rispetto a quella di p35S. Consideriamo la figura 69, la banda di epsp e` visibile solo se la reazione di amplificazione viene condotta su almeno 50 ng di DNA genomico, mentre la banda di p35S e` visibile gia` partendo da 2,5 ng di DNAg per reazione. In seguito pero` il saggio non conferma questa differenza iniziale facendo registrare dei valori di LOD, LOQ, RSDr e RSDR paragonabili
rispetto a quelli osservati per p35S. Questa evidenza ci permette di confidare nel metodo per lo screening multiplo di numerosi eventi simultaneamente. In un’unica amplificazione si potrebbero “marcare” i diversi target da identificare in seguito con lo strumento Luminex. La marcatura dei target condotta tramite PCR puo` assicurare che per ogni target ci sia, alla fine dei cicli di amplificazione, un numero minimo di molecole marcate che possono essere individuate dallo strumento Luminex. Essendo questa applicazione del metodo puramente qualitativa, non e` piu` determinante l’efficienza di reazione delle singole reazioni di amplificazione, ma solo che alla fine dei cicli di amplificazione ogni target sia rappresentato da un numero di molecole marcate visibili
allo strumento. Attualmente si sta implementando il sistema cercando di ottimizzare il saggio per un numero minimo di dieci target.