ASSOCIAZIONE DELL’ESPRESSIONE DI GrB CON LA TRANSIZIONE EPITELIO MESENCHIMALE (EMT) DEL TUMORE

Il fenomeno di transizione epitelio-mesenchimale (EMT) è ritenuto un evento chiave nell’invasione di numerosi carcinomi(Thiery, 2006), inclusi gli UCs (Lipponen and Eskelinen, 1995; Lascombe et al., 2006; Baumgart et al., 2007; Bryan et al., 2008). La caratteristica essenziale delle cellule neoplastiche che vanno incontro ad EMT è la perdita dei contatti intercellulari fra le cellule tumorali epiteliali, con conseguente acquisizione di un fenotipo di tipo mesenchimale: le cellule tumorali si distaccano dalle cellule adiacenti e aumentano la loro mobilità e capacità di degradazione della matrice, in tal modo da migrare e invadere (Thiery, 2006). La proteina zinc finger Snail è un fattore di trascrizione considerato come un promotore dello stato di EMT; agisce come organizzatore molecolare che modula negativamente i geni caratteristici delle cellule epiteliali (tra i quali E- caderina) e modula positivamente i geni caratteristici del fenotipo mesenchimale (Thiery, 2006). È stato dimostrato che la modulazione negativa o la perdita dell’espressione in membrana di E-caderina (responsabile della perdita di adesione delle cellule), può essere accompagnata da una neo- espressione di N-caderina, una proteina propria della cellula mesenchimale (Thiery, 2006; Lascombe et al., 2006; Bryan et al., 2008).Pertanto, per valutare un possibile ruolo di GrB nell’invasione in UCs, è stata caratterizzata EMT nei campioni di UCs a nostra disposizione con lo scopo di analizzare un’eventuale associazione fra GrB e EMT in questi tumori. Quindi, tessuti di carcinoma uroteliale positivi e negativi per GrB sono stati analizzati mediante immunoistochimica per valutare l’espressione dei tre marcatori molecolari di EMT, quali Snail, E- e N-caderina. In accordo con la letteratura (Lipponen and Eskelinen, 1995; Lascombe et al., 2006; Baumgart et al., 2007; Bryan et al., 2008), abbiamo trovato significative differenze di espressione (P<0.01 χ² di Pearson per tutti i marcatori) di Snail, E- e N-caderina e lo stadio di invasività in UCs (Table I). L’analisi dell’associazione fra GrB e EMT non ha mostrato differenze significative di espressione (P=0.061 test di Friedman; Table II) nei tumori positivi per GrB e positivi anche per Snail, E- e N-caderina. All' interno di 42 tumori che esprimevano GrB, 39 (93%) esprimevano anche Snail, 40 (95%) erano negativi per l'espressione in membrana di E-caderina (a causa della dislocazione della proteina dalla membrana al citoplasma), e 42 (100%) erano positivi per N-caderina (Table II). Inoltre, abbiamo osservato che Snail, N-caderina e la perdita di E-caderina erano maggiormente associate a GrB nelle zone di invasione del tumore, dove l’espressione di GrB è più intensa (fig. 14a). Quindi, siamo andati a vedere se GrB fosse espresso nelle stesse cellule neoplastiche che andavano incontro ad EMT. A tal proposito, è stata effettuata una doppia immunofluorescenza tra GrB e i biomarcatori di EMT su

le cellule positive per GrB esprimono anche Snail o N-caderina, o sono negative in membrana per E- caderina. L’insieme di questi dati mostra una forte associazione tra GrB e EMT, rafforzando l'idea di un ruolo di GrB nell’ invasione dei carcinomi uroteliali.

FIG. 14 Associazione di GrB con lo stato di transizione epitelio-mesenchimale in tessuti di carcinomi uroteliali (UCs). (a) Colorazione

rappresentativa mediante immunoistochimica delle cellule basali neoplastiche nella papilla del tumore, in cui sono stati utilizzati gli anticorpi monoclonali anti-GrB, anti-E-caderina o anti-N-caderina, o l’anticorpo policlonale anti-Snail. La reazione di colorazione è mostrata in marrone e controcolorata con ematossilina. (b) Doppia immunofluorescenza rappresentativa in UCs di tipo invasivo, in cui sono stati utilizzati gli anticorpi monoclonali anti-GrB-PE, anti-E-Caderina (FITC), o anti-N-caderina (FITC), o l’anticorpo policlonale anti-Snail (FITC); le frecce indicano il dislocamento citoplasmatico di E-caderina. Le immagini sono state ottenute con i seguenti ingrandimenti originali: x200 (a); x1000 (b).

4.5 GrB ESPRESSA DAI TUMORI E’ ENZIMATICAMENTE ATTIVA

Per valutare la funzionalità di GrB in linee cellulari tumorali di vescica, abbiamo analizzato, nei lisati cellulari di 1512 e RT112 (cellule tumorali di vescica esprimenti GrB), l’attività enzimatica di GrB mediante un saggio esterolitico utilizzando un sustrato specifico per GrB, quale AcIEPD-pNA (Velotti et al., 1992; Mahrus and Craik, 2005). I lisati cellularidelle linee YT-S e T24 sono stati usati, rispettivamente, come controllo positivo e negativo. Come mostrato nella fig. 15a, un' attività di conversione del substrato, di entità diversa da cellula a cellula, è stata osservata sia in cellule positive per GrB che in cellule negative. Per verificare se l'attività enzimatica fosse ascrivibile a GrB, i lisati sono stati incubati con un anticorpo monoclonale diretto verso GrB (2C5-F5), immobilizzato su biglie di sefarosio. Quindi, in seguito alla deplezione di GrB, abbiamo osservato una riduzione significativa (P<0.0001) dell’attività enzimatica sia nella linea tumorale 1512 che in RT112, mentre non è risultata influenzata l’attività enzimatica di T24 (linea cellulare non esprimente GrB) (fig. 15a). Inoltre, l'incubazione di lisati con un anticorpo monoclonale irrilevante, non ha modificato le attività enzimatiche (fig. 15a).

4.6 GrB ESPRESSA DAI TUMORI DEGRADA LA VITRONECTINA

E' stato dimostrato che GrB umano è in grado di degradare i componenti della ECM, quale la vitronectina. GrB rappresenta la prima proteinasi nota di mammifero in grado di tagliare la vitronectina dopo il motivo l'Arg-Lys-Asp (RGD), che fa parte del sito di legame delle integrine alle proteine della matrice (Buzza et al., 2005).

Pertanto, per indagare ulteriormente la funzione di GrB, abbiamo analizzato la capacità di GrB, in lisati ottenuti dalle linee tumorali 1512 e RT112, di degradare la vitronectina; le cellule YT-S sono state utilizzate come controllo positivo; RT4 e UM-UC-3 come controllo negativo. Come mostrato nella fig. 15b, l'incubazione dei lisati cellulari delle linee tumorali RT112, 1512 e YT-S (positive per GrB) con la vitronectina per 4 ore, ha generato dei frammenti di vitronectina con un peso molecolare più basso di 5-10 kDa rispetto alle bande di 75 e di 65-kDa proprie della vitronectina integra. Nello studio pubblicato da Buzza e colleghi nel 2005, sono stati mostrati simili prodotti di frammentazione, che sequenziati, sono risultati corrispondere al sito RGD, substrato specifico dell’azione proteolitica di GrB nell’uomo (Buzza et al., 2005).

Per verificare se la proteolisi osservata fosse veramente imputabile a GrB, il test di degradazione della vitronectina è stata effettuato in presenza di un inibitore sintetico specifico per GrB, quale Z-