L’attività di scarica dei neuroni del RMTg e il loro tono inibitorio sulle cellule

Le registrazioni elettrofisiologiche dell’attività di scarica spontanea dei neuroni GABAergici si sono concentrate su quella che Jhou (2009a) ha definito core. La core del RMTg risulta essere situata medialmente rispetto all’intera area che prevede

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anche una periferia (vedi figura 1.6). Nella core si concentra il maggior numero di neuroni positivi al GAD67, che esprimono la proteina Fos a seguito di trattamento con psicostimolanti. Inoltre, la scelta è caduta sulla core anche in quanto è stato dimostrato che neuroni del RMTg e le loro proiezioni al mesencefalo sono organizzate topograficamente (Goncalves et al., 2011): i neuroni del RMTg che risiedono nella periferia proiettano maggiormente alla SNc mentre quelli della core alla VTA. La conferma istologica ha permesso di scartare le cellule non propriamente in area.

I neuroni del RMTg, nell’animale anestetizzato, scaricano relativamente ad alta frequenza con un pattern alquanto regolare. Preventivamente sono state scartate cellule a basse frequenze, onde evitare la registrazione di neuroni contenenti serotonina dei nuclei del rafe (Schweimer et al., 2011) che risultano in posizione mediale ed adiacente al RMTg. I nostri dati sulla frequenza spontanea delle cellule del RMTg, siti nella core, differiscono da quelli prodotti da Jhou su animali liberi di muoversi. In particolar modo la frequenza di scarica spontanea e la durata dei potenziali d’azione risultano rispettivamente inferiore e maggiore a quelle riportate dall’autore (Jhou et al., 2009a). Queste dicotomie sono facilmente interpretabili alla luce delle differenti condizioni sperimentali: animale sveglio vs animale anestetizzato e differenti filtri usati per le registrazioni. A conferma di questa idea, recentemente Jalabert e colleghi (2011) hanno registrato i neuroni del RMTg, identificati in base alla loro risposta alla stimolazione della LHb, su animale anestetizzato. In questo caso non vi son differenze tra i dati da noi riportati ed i parametri delle cellule considerate dagli autori.

4.2.1 Il RMTg riceve proiezioni eccitatorie dalla LHb e invia proiezioni inibitorie alla VTA

La stimolazione elettrica della LHb ha permesso di isolare una popolazione distinta di cellule del RMTg innervate dalle sue proiezioni. Il 46% dei neuroni testati nel RMTg venivano eccitati a breve latenza dallo stimolo elettrico della LHb. La risposta presentava una latenza media di 5 ms dallo stimolo in linea con un meccanismo monosinaptico. A conferma di ciò, è utile seguire un semplice ragionamento matematico. Come riportato da Ji e Shepard (2007), essendo la velocità di

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conduzione degli assoni glutamatergici della LHb all’incirca 2 m/s (Park, 1987), un’innervazione diretta sui neuroni GABAergici della VTA richiederebbe una risposta pari a 3.2 ms. Questo, in quanto, alla distanza media stimata tra le due aree in questione (2.7 mm), si deve sommare il ritardo di risposta dovuto ai meccanismi sinaptici. I risultati dei due ricercatori confermano questo dato. Di riflesso, essendo la distanza media tra la LHb e il RMTg pari a 4.7 mm, noi ci aspetteremo una latenza di risposta all’incirca di 5.6 ms. I nostri dati, confermano in pieno il calcolo precedente. Successivamente, le risposte ortodromiche dei neuroni del RMTg alla stimolazione della LHb sono state osservate da un altro gruppo di ricerca sui primati (Hong et al., 2011).

Un altro dato interessante deriva dal fatto che le proiezioni provenienti dalla LHb innervano in maggior parte neuroni GABAergici che proiettano a loro volta in VTA (Goncalves et al., 2011). La comprova di questo deriva dalla risposta dei neuroni DAergici alla stimolazione del RMTg. Infatti, l’inibizione, presente in circa metà delle cellule testate, perdura per 82.6 ms e avviene immediatamente dopo lo stimolo. L’assenza di una latenza visibile è in linea con un meccanismo monosinaptico e con una velocità di conduzione rapida, tipica dei neuroni GABAergici. Di fatto, eventuali potenziali d’azione potrebbero cadere a cavallo dell’artefatto prodotto dallo stimolo, e per questo non visualizzabili. La potente influenza inibitoria del RMTg sarebbe cosi confermata dai nostri dati. Confrontando i risultati derivanti dalla stimolazione del RMTg con precedenti lavori nei quali la stimolazione è avvenuta in LHb, (Christoph et al., 1986; Ji & Shepard, 2007) sorprende quanto le risposte siano simili sia per la durata media che per il range. Tuttavia un dato resta discordante, ovvero la stimolazione elettrica della LHb produce una risposta inibitoria disinaptica in una percentuale altissima di neuroni DAergici (~97%). Quindi alla luce dei nostri risultati, non tutto il potere inibitorio della LHb nella VTA richiederebbe l’intermediazione del RMTg. Va comunque precisato, che la nostra, potrebbe essere una sottostima in quanto le stimolazioni, si sono concentrate in un solo punto del RMTg, che si estende in modo notevole in senso rostro-caudale, ed è ragionevole considerare che non tutte le proiezioni siano state coinvolte. Futuri studi con l’ausilio di nuove tecniche optogenetiche potrebbero chiarire questo punto.

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4.2.2 Il RMTg controlla l’attività di scarica dei neuroni DA della VTA

L’analisi correlazionale ha dimostrato una forte correlazione negativa tra la frequenza di scarica spontanea dei neuroni DAergici registrati nella VTA e l’entità della loro risposta inibitoria. Una correlazione inversa seppur meno marcata è stata registrata anche nella percentuale di potenziali in bursts e la durata dell’inibizione. Questi dati vanno sommati alla correlazione tra il pattern di scarica dei neuroni DAergici e la forza dell’inibizione indotta da stimolazione del RMTg. La risposta inibitoria all’attivazione del RMTg è stata registrata sia in cellule classificate come regolari, irregolari e in burst. Le cellule classificate come irregolari, comunque, sembrano avere una maggiore componente inibitoria rispetto ai neuroni in differente modalità di scarica. Considerando la vasta mole di evidenze che mettono in luce come l’attività dei neuroni DAergici sia in parte mediata dal bilancio tra input eccitatori ed inibitori (Meltzer et al., 1997; Kitai et al., 1999; Floresco et al., 2003; Marinelli et al., 2006), il nostro dato potrebbe far pensare ad una forte influenza del RMTg nel controllo dell’attività e del pattern di scarica dei neuroni DAergici della VTA. Di fatto è stato recentemente dimostrato che una temporanea inibizione farmacologica del RMTg produce un incremento dell’attività di scarica dei neuroni DAergici della VTA (Jalabert et al., 2011).

4.2.3 RMTg-VTA: via preferenziale per la codifica degli stimoli avversivi?

Un ulteriore interpretazione dei nostri dati, deriva dall’analisi delle risposte al pinzettamento della zampa sia sulle cellule del RMTg che sui neuroni DAergici della VTA. Il 72.3% dei neuroni del RMTg esaminati rispondevano allo stimolo nocicettivo con una risposta eccitatoria fasica rapida. Questo dato è molto simile a quello riportato nei ratti liberi di muoversi in risposta ad uno shock elettrico della zampa (Jhou et al., 2009a). È interessante sottolineare come stimoli avversivi siano in grado di incrementare l’espressione della proteina Fos nel RMTg specificatamente in cellule positive al GAD67 (Jhou et al., 2009a).

Nel caso dell’analisi delle risposte dei neuroni DAergici al pinzettamento, abbiamo scelto di procedere non per singoli neuroni, ma per popolazioni. In quanto, tenendo conto dell’eterogeneità delle risposte di questi neuroni ad uno stimolo nocicettivo (Brischoux et al., 2009), il nostro interesse si è concentrato sui neuroni innervati dal

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RMTg. I dati ottenuti, mostrano chiaramente come i neuroni inibiti dal RMTg siano a loro volta propensi a codificare il pinzettamento breve della zampa con un decremento fasico della loro frequenza. È interessante notare, come la risposta inibitoria di questi neuroni sia molto più pronunciata e significativa rispetto a quella dei neuroni non inibiti dal RMTg.

In una visione d’insieme, questi dati confermano il prominente ruolo del RMTg nella codifica degli stimoli avversivi. Inoltre aggiungono un dato interessante sulla possibile spiegazione dell’eterogeneità della risposta dei neuroni DAergici agli stessi stimoli. In linea con quanto asserisce Hong et al. (2011), le sinapsi inibitorie RMTg-VTA potrebbero inviare il segnale negativo correlato a gratificazione alla VTA, così da permettere le risposte inibitorie esclusivamente nei neuroni DAergici innervati dal RMTg. Tuttavia a causa dei limiti del protocollo da noi utilizzato, questo dato andrebbe confermato con studi di marcatura del fenotipo neuronale (esempio juxtacellular) e uso di traccianti (esempio tracciante anterogrado in RMTg).