L’AZA è un profarmaco della 6-mercaptopurina (6-MP) e, come quest’ultima, funziona come un antimetabolita purinico con proprietà immunosoppressive.
La biodisponibilità dell’AZA (80%) è maggiore di quella della 6-MP (50%). L’AZA, dopo essere stata assorbita dal tratto gastrointestinale, viene rapidamente trasformata, non
enzimaticamente, in 6-MP per rimozione del gruppo imidazolico ad opera di sostanze
contenenti gruppi sulfidrilici quali il glutatione, ciò si verifica negli eritrociti e in altri
tessuti. Successivamente viene metabolizzata a livello epatico in 6-tioinosina
5-monofosfato (TIMP) dall’enzima ipoxantina guanina fosforibosiltransferasi (HGPRT). In questa maniera l’enzima HGPRT catalizza il primo passaggio delle vie metaboliche di attivazione delle tiopurine che conducono alla formazione dei vari metaboliti attivi
(nucleotidi 6-tioguaninici), la cui azione citotossica e immunosoppressiva si esplica mediante l’inibizione della sintesi proteica e della replicazione e riparo del DNA, grazie all’incorporazione di quei metaboliti attivi negli acidi nucleici47
.
La 6-MP segue due vie di catabolizzazione: la prima catalizzata dall’enzima xantina
ossidasi (XO), che trasforma una grande quantità del composto attivo in acido 6-tiourico prima dell’eliminazione urinaria, la seconda catalizzata dalla tiopurina-S-metiltransferasi (TPMT), che porta alla formazione di 6-metilmercaptopurina (6-MMP).
A parità di dose somministrata i livelli dei diversi metaboliti/cataboliti delle tiopurine
dipendono da età, sesso (attività media più elevata nei maschi) e stato fisico del soggetto
(funzionalità epatica e renale), nonché dalle attività relative degli enzimi TPMT, XO e HGPRT. In generale, però, possiamo dire che circa l’84% della 6-MP è rapidamente metabolizzata dall’enzima XO, che si trova ad alte concentrazioni negli eritrociti e negli epatociti, mentre il restante 16% è metabolizzato dall’enzima TPMT ed HGPRT47
38
Figura 3. Schema del metabolismo delle tiopurine.
AZA = azatioprina; 6-MMP = 6-metil-mercaptopurina; 6-MMPR = 6-metil-mercaptopurina ribonucleotide; 6-MP = 6-mercaptopurina; 6-MTGN= 6-metil-tioguanina nucleotide; 6-TGDP= 6- tioguanosina 5-difosfato; 6-TGMP = 6-tioguanosina 5-monofosfato; 6-TGTP = 6-tioguanosina 5- trifosfato; 6-TIMP = 6-tioinosina 5-monofosfato; 6-TU = acido 6-tiourico; 6-TXMP = 6-tioxantina monofosfato; GMPS = guanosina monofosfato sintetasi; HGPRT = ipoxantina guanina fosforibosiltransferasi; IMPDH = inosina monofosfato deidrogenasi; TPMT = tiopurina-S-metil- transferasi; XO = xantina ossidasi.
39
In seguito a somministrazione di AZA, piccole quantità del farmaco non modificato e di mercaptopurina sono eliminate attraverso l’emuntorio renale, ed in pazienti anefrici o anurici si può verificare una tossicità circa 2 volte superiore. Dal momento che la maggior parte dell’inattivazione del farmaco dipende dall’enzima XO, pazienti che siano sotto trattamento con allopurinolo, per il controllo dell’iperuricemia, dovrebbero essere trattati con dosi di AZA pari a un quarto/un terzo rispetto a quelle che vengono di solito somministrate, in modo da prevenire l’insorgenza di un grave quadro tossico.
AZA e 6-MP hanno emivite di eliminazione plasmatica inferiori alle 2 ore (l’emivita plasmatica dell’azatioprina è di circa 10 minuti, quella della 6-MP è, invece, di circa 1 ora); i metaboliti attivi di questi farmaci, i nucleotidi 6-tioguaninici (6-TG), sono però concentrati nelle cellule e ciò ha come risultato il prolungamento dell’emivita fino a giorni. Le lunghe cinetiche dei nucleotidi 6–TG, hanno come conseguenza una latenza media di 17 settimane prima che si osservi l’inizio di un beneficio terapeutico nei pazienti trattati per via orale con AZA o 6-MP.
Questi ultimi sembrano produrre immunosoppressione per interferenza con il metabolismo
delle purine in fasi critiche dell’ondata di proliferazione di cellule linfoidi che segue alla stimolazione antigenica. L’AZA esplica un’azione soppressiva sia sui linfociti T che B, particolarmente sensibili sono le cellule in fase S ed all’inibizione della proliferazione segue la morte cellulare apoptotica. L’AZA è potente nell’inibire la proliferazione di cellule immunocompetenti stimolate dall’antigene (risposta primaria), mentre è meno efficace su cellule della memoria (risposta secondaria). La maggiore resistenza delle
cellule della memoria è dovuta alla loro minore attività proliferativa, rispetto alle cellule
coinvolte nella risposta primaria, ed ai meccanismi fisiologici di protezione della morte
40
In presenza di attivazione T cellulare, come avviene nelle malattie immunomediate, i
nucleotidi 6-TG bloccano l’espressione di TRAIL, TNFRSF 7 ed α4-integrina, con effetto finale di riduzione dell’infiammazione. Il TRAIL (related apoptosis inducing ligand), conosciuto anche come ligando Apo-2, è un membro della superfamiglia di citochine TNF,
ampiamente espresso dalla cellule del sistema immune, in particolar modo dai linfociti. La
sua produzione è indotta da diversi stimoli associati ai processi infiammatori. TRAIL agisce attraverso DR4 determinando l’attivazione di caspasi con relativa apoptosi cellulare. TNFRSF 7 (CD27) è un membro della superfamiglia dei recettori TNF coinvolto nella regolazione dell’attivazione dei linfociti T. La down-regulation dell’AZA su TNFRSF 7 riduce la risposta dei linfociti T all’attivazione, determinando come esito finale l’inibizione della migrazione dei T linfociti o dei monociti dai vasi ai siti di infiammazione48.
41
3.1
Farmacogenomica
La farmacogenomica è un nuovo capitolo della farmacologia che spiega la correlazione tra
polimorfismo strutturale dei geni e la variabilità interindividuale della risposta alle terapie
farmacologiche.
Un gene viene considerato funzionalmente polimorfico quando una variante stabile, che altera le proprietà dell’attività di una proteina, è presente con un certo livello di frequenza nella popolazione. Il fenotipo è definito dall’espressione visibile del genotipo. In farmacogenomica il fenotipo è usato come per valutare, ad esempio, il livello di attività di
un enzima implicato nel metabolismo di una classe di farmaci. Il genotipo può essere
utilizzato per determinare le basi molecolari di un fenotipo.
Nello specifico, per quanto riguarda l’enzima TPMT, da due decenni è oramai noto che l’attività di questo enzima è caratterizzata da un’ampia variabilità interindividuale. La differente attività di TPMT viene ereditata per modalità autosomica codominante.
La variabilità dell’enzima TPMT assume un andamento trimodale nella popolazione49 : circa il 90% degli individui presenta un’alta attività metabolica, il 10% presenta un’attività intermedia e, infine, lo 0,3% presenta livelli bassi o non determinabili di attività
enzimatica50. Numerosi studi hanno dimostrato come tale variabilità fenotipica sia
ascrivibile in buona parte ad una corrispondente variabilità genotipica del gene TPMT. I
pazienti con attività intermedia sono eterozigoti per il gene che codifica per TPMT, mentre
i soggetti con deficit di attività sono omozigoti per gli alleli a bassa attività.
L’enzima TPMT è codificato da un gene di 27 kb sul cromosoma 6 p22.3. Questo gene ha 10 esoni che codificano per una proteina di 28 kDa. Sono stati descritti ad oggi 18 diversi alleli associati ad un’attività enzimatica alterata rispetto a quella espressa dall’allele wild-type (TPMT*1).
42
Figura 4. Varianti alleliche del gene che codifica per TPMT.
Allele Nucleotide Aminoacidi
TPMT*1 WT
TPMT*2 238 GC 80 AlaPro
TPMT*3A 460 GA 154 AlaThr
719 AG 240 TyrCys TPMT*3B 460 GA 154 AlaThr TPMT*3C 719 AG 240 TyrCys TPMT*3D 460 GA 154 AlaThr 719 AG 240 TyrCys 292 GT 98 GluX
TPMT*4 _1 GA (intron 9) Splicing defect
TPMT*5 146 TC 49 LeuSer TPMT*6 539 AT 180 TyrPhe TPMT*7 681 TG 227 HisGln TPMT*8 644 GA 215 ArgHis TPMT*9 356 AC 119 LysThr TPMT*10 430 GC 144 GlyArg TPMT*11 395 GA 132 CysTyr TPMT*12 374 CT 125 Ser Leu TPMT*13 83 AT 28 GluVal TPMT*14 1 AT 1MetVal
TPMT*15 _1 GA (intron 7) Splicing defect
TPMT*16 488 GA 163 ArgHis
TPMT*17 124 CG 42 GlnGlu
43
La maggior parte degli alleli però risulta molto rara nella popolazione, infatti da soli gli alleli TPMT*2, TPMT*3A e TPMT*3C rendono conto dell’80-95% dei casi di deficienza ereditaria dell’attività dell’enzima TPMT nella popolazione51
. Esiste inoltre una variabilità
inter-etnica nella frequenza degli alleli principali: nei soggetti caucasici l’allele non funzionale più frequente è l’allele TPMT*3 (4.5%), mentre il TPMT*3C è il più frequente tra le popolazioni africane e asiatiche (rispettivamente 5.4-7.6% e 0.3-3%)52.
Figura 5. Caratteristiche e frequenze nella popolazione italiana dei principali alleli del gene TPMT.
Allele Sostituzione di base Variazione aminoacidica
Attività (% rispetto a WT)
Frequenza nella popolazione italiana
TPMT*1 Wild type Wild type 100 0.9466
TPMT*2 G238C A80P 26.0 0.0049
TPMT*3A G460A + A719G A154T+ Y240C 1.6 0.0388
TPMT*3B G460A A154T 1.7 0
TPMT*3C A719G Y240C 17.0 0.0097
44
In uno studio52 condotto su 1214 soggetti caucasici la concordanza tra genotipo e fenotipo è stata dimostrata essere complessivamente superiore al 98% (89.2% tra l’eterozigosi per un allele non funzionale e il fenotipo metilatore intermedio e 99.4% tra l’omozigosi wild-type e il fenotipo normale/elevato metilatore). Nel caso di metabolizzatori intermedi
la correlazione è meno stretta. Solo dal 57% al 63% dei metilatori intermedi possono
essere spiegati dagli alleli TPMT conosciuti. La discrepanza genotipo-fenotipo può essere
spiegata dalla possibile influenza di fattori genetici che coinvolgono elementi regolatori del gene TPMT o altri loci che influenzano l’inibizione di TPMT da parte di farmaci concomitanti. In teoria lo status di TPMT nei pazienti può essere misurato attraverso il
fenotipo (attività di TPMT) o attraverso il genotipo. A causa della difficile interpretazione
delle conseguenze di nuovi polimorfismi nei differenti gruppi etnici e la possibilità di non evidenziare variazioni alleliche clinicamente rilevanti, l’analisi del genotipo potrebbe essere considerata inattendibile.
La variabilità genetica nell’attività di TPMT influenza sia la tossicità ma anche l’efficacia dell’AZA. Gli individui con livelli bassi o indosabili di attività di TPMT presentano maggiori concentrazioni di metaboliti attivi 6-TGN e mielosoppressione farmaco-indotta,
ciò accade perché TPMT riduce la disponibilità di 6-MP per la conversione a 6-TGN. L’attività di TPMT è dunque inversamente correlata con i livelli di metaboliti attivi della 6- MP. Uno studio53 condotto su pazienti con EAI mostra una stretta correlazione tra genotipo e fenotipo. L’attività di TPMT risultava significativamente inferiore nei pazienti intolleranti all’AZA, mentre i pazienti steroido-dipendenti presentavano un’elevata attività di TPMT e pertanto inattivavano il farmaco molto più rapidamente. Nell’ambito dello studio emergevano diverse anomalie: casi di pazienti con variante TPMT difettiva con
attività enzimatica intermedia che tolleravano normalmente il farmaco. Tali anomalie di
45
5’promoter del gene TPMT, tale polimorfismo è legato ad un numero variabile di coppie ripetute (VNTRs) di 17 o 18 unità di basi nella regione promoter che sembra influire nella
regolazione della trascrizione genica. In particolar modo, è stata osservata una correlazione
inversa tra numero di VNTR e genotipo TPMT: soggetti eterozigoti con basso numero di VNTRs possono compensare l’allele difettivo e produrre un’adeguata quantità di enzima54
.
Un recente studio, condotto allo scopo di analizzare la prevalenza dei vari genotipi di
TPMT e la loro associazione con effetti avversi farmaco-indotti in pazienti del sud-est del
Brasile con malattie infiammatorie croniche intestinali, non ha identificato alcuna
associazione significativa tra i polimorfismi del gene TPMT ed epatotossicità e
mielotossicità55. Anche se è stata evidenziata una possibile associazione dei genotipi
TPMT*2 e TPMT*3C con alterazioni pancreatiche.
Un altro fattore da considerare nella variabilità genotipo/fenotipo è l’influenza dell’attività dell’enzima HPRT. Il gene HPRT è localizzato nel cromosoma X nella posizione Xq26. Sono state descritte più di 2000 mutazioni nel gene HPRT, molte delle quali sono causa di
un deficit parziale o totale di HPRT e responsabili di un ampio spettro di disordini del metabolismo delle purine, dall’iperuricemia a diverse condizioni come la Sindrome di Lesh-Nyan. Gli individui con bassa attività di TPMT ed associate mutazioni di HPRT con
bassa produzione di HPRT stesso, potrebbero, presumibilmente, non solo detossificare
meno AZA ma anche presentare una minore conversione a 6-TGN e quindi presentare una
minore tossicità56.
La complessità della farmacogenomica dell’azatioprina pone il problema dell’utilità della
determinazione routinaria del genotipo e/o del fenotipo di TPMT in pazienti con epatopatie
autoimmuni. Indubbiamente i pazienti con allele TPMT difettivo e intermedia o bassa
attività di TPMT possono essere trattati con dosi inferiori di AZA. Il fenotipo può risultare
46
genotipo/fenotipo. Ciò infatti permetterebbe l’identificazione di pazienti potenzialmente intolleranti all’AZA e, allo stesso tempo, potrebbe anche semplificare l’identificazione di alti metilatori che perciò richiederebbero dosi più elevate di farmaco per ottenere l’effetto terapeutico.
47
3.2
Indicazioni
L’AZA è un farmaco con molteplici indicazioni.
Essa è indicata nel trattamento delle forme di artrite reumatoide resistenti ad altri farmaci, nell’artrite psoriasica, nell’artrite reattiva, nel lupus eritematoso sistemico, nella sindrome di Behçet, nella dermatomiosite – polimiosite in pazienti refrattari al trattamento con
corticosteroidi.
L’AZA risulta di chiara efficacia nel mantenimento di trapianti allogenici di rene e può anche essere utile nel trapianto di altri tessuti. Il trattamento inizia in genere due giorni
prima del trapianto.
Può essere usata in associazione a corticosteroidi nelle MICI, oltre che nelle malattie
autoimmuni del fegato e delle vie biliari.
Inoltre è impiegata in anemie emolitiche autoimmuni e nella porpora idiopatica
trombocitopenica, nelle forme mediate da anticorpi e resistenti ai corticosteroidi.
48
3.3
Effetti avversi
L’AZA è un farmaco abbastanza sicuro, raramente responsabile di effetti secondari gravi.
Effetti avversi sul sistema ematopoietico e sulla coagulazione
La più importante azione tossica esplicata dall’AZA nel breve termine è rappresentata dalla mielosoppressione, che si verifica nel 2-5% dei casi. Di solito si manifesta sotto forma di
leucopenia57, sebbene possano anche insorgere anemia (in genere macrocitica) e trombocitopenia. Il meccanismo con cui l’AZA induce la macrocitosi non è chiaro, ciò potrebbe essere dovuto ad una inibizione della sintesi del DNA nei precursori presenti nel midollo osseo, lasciando inalterata, invece, la sintesi dell’RNA e delle proteine con un progressivo accumulo di acidi nucleici nella cellula58. In pazienti con MICI una leucopenia
grave compare solo nel 3% dei casi59. L’effetto mielosoppressivo è dose correlato e migliora con la riduzione della posologia o la sospensione del farmaco. È raccomandato il monitoraggio routinario dell’emocromo a cadenza settimanale per le prime 4 settimane, ogni 2 settimane per le successive 4 settimane e in seguito ogni 1-2 mesi per tutta la durata
del trattamento. Il monitoraggio seriale dei fenomeni di mielosoppressione è sicuramente
insostituibile per la sicurezza dei soggetti trattati con tiopurine, tuttavia l’efficacia di tale
strumento dipende fortemente dalla compliance dei pazienti e nulla può nel prevenire tali
reazioni avverse.
Una recente pubblicazione60 suggerisce un ruolo causale dell’AZA e della 6-MP nella riduzione dell’attività del fattore V e della protrombina (PT), confermando dunque quanto precedentemente riportato in letteratura in altri sei casi61, 62. La riduzione dell’attività del fattore V e della PT non ha portato tuttavia alla comparsa di importanti conseguenze, anzi
49
riduzione transitoria, in quanto, a seguito della sospensione del trattamento farmacologico,
la ripresa è stata completa. Il meccanismo alla base di questa alterazione non è stato ancora
chiarito.
Effetti avversi gastrointestinali
Nei pazienti con MICI trattati con AZA o 6-MP, è stata riportata un’incidenza di pancreatite pari all’1.3-3.3%; l’effetto è dose-indipendente e tipicamente si verifica entro le prime 3-4 settimane dall’avvio del trattamento. La pancreatite generalmente si risolve alla
sospensione del farmaco e riprende con la riesposizione ad esso.
Altri possibili effetti gastrointestinali includono nausea, vomito, anoressia e dolore
addominale. Si tratta di effetti comuni ma in genere di modesta entità.
Epatotossicità
L’epatotossicità è una complicanza poco frequente ed il tipo esatto di alterazione non è noto. Il meccanismo di danno agli epatociti comprende la deplezione di GSH dovuta alla
formazione di radicali liberi a seguito del danno mitocondriale, la deplezione di ATP e la
necrosi cellulare63. Lo spettro del danno epatico va dall’innalzamento asintomatico degli enzimi epatici, alla colestasi, all’iperplasia rigenerativa nodulare e al danno endoteliale sinusoidale (peliosi)64, 65. Dalla revisione della letteratura risulta che la maggior parte degli studi che valutano la tossicità epatica dell’AZA sono studi condotti su pazienti con MICI, in cui il parametro di riferimento è rappresentato da un innalzamento dei valori delle
transaminasi. In pazienti con epatopatie, in cui già è possibile ritrovare un innalzamento
dei livelli delle aminotransferasi a causa della malattia, diventa di difficile interpretazione
50
Infezioni
L’AZA può provocare aumento della suscettibilità alle infezioni; sono state descritte complicanze infettive quali la malattia disseminata da citomegalovirus, ascessi epatici,
polmonite, listeriosi cerebrale, herpes zoster, flebite settica con artrite, epatite virale, febbre
Q, colite da citomegalovirus. Molti di questi effetti possono presentarsi anche in presenza
di una normale conta leucocitaria66.
Altri effetti avversi aspecifici
Sono anche possibili reazioni non specifiche quali eruzioni cutanee, caduta di capelli,
febbre (in cui sono state escluse altre possibili cause67), mialgie e artralgie. Tali effetti sono
generalmente dose-indipendenti e rispondono alla sospensione del trattamento.
AZA in gravidanza
L’AZA è un farmaco classificato in categoria Dg
secondo l’FDA (Food and Drug
Administration), ciò quindi implica che si tratti di un farmaco potenzialmente rischioso per
il feto. I rischi maggiormente connessi all’uso dell’AZA in gravidanza sono rappresentati
dal parto pretermine, un basso peso alla nascita o la comparsa di anomalie congenite. Per evitare tali rischi, in caso di inizio del trattamento in un’adolescente fertile, si ritiene opportuno scongiurare un’eventuale gravidanza6 o, nel caso in cui la donna rimanesse
comunque incinta, si preferisce piuttosto utilizzare basse dosi di steroidi68.
Dalla revisione della letteratura, comunque, emerge che in diverse gravidanze, sia di donne con MICI che con EAI, l’AZA si è dimostrata abbastanza sicura sia per la madre che per il feto69-72. Nello studio retrospettivo multicentrico di Casanova et al. pubblicato lo scorso
g
I farmaci in classe D sono quelli in cui studi sull’uomo e i dati di farmacovigilanza hanno evidenziato un rischio per il feto, tuttavia i potenziali benefici del farmaco potrebbero giustificarne l’utilizzo nella donna in gravidanza nonostante i potenziali rischi per il feto.
51
anno, si è indagato proprio sulla sicurezza delle tiopurine e degli anti-TNFα in gravidanza,
in donne con diagnosi di MICI. Dallo studio è emerso che, non solo le tiopurine non sono
connesse ad un aumento del rischio di complicanze durante la gravidanza, ma sembrano sicure anche per il nascituro. Infatti, dal confronto tra tre gruppi: uno in cui non c’era esposizione ad alcun farmaco (318 donne), un gruppo di esposte alla sola AZA (187
donne) e un gruppo di esposte ai soli anti-TNFα (66 donne), il tasso di complicanze
neonatali era significativamente più basso tra le donne esposte alla sola AZA rispetto a
quelle non esposte ad alcun farmaco (p=0,01). Dall’analisi multivariata è persino emerso
che il trattamento con tiopurine (odds ratio= 0.6; intervallo di confidenza al 95% =0.4-0.9, p=0,02) risultava l’unico predittore di un GPO (Global Pregnancy Outcome)h
favorevole.
Si tenga conto che uno scarso controllo di malattia negli anni che precedono la gravidanza
si associa, invece, a possibili complicanze71.
Anche per quanto riguarda il periodo dell’allattamento, l’assunzione di AZA da parte della
madre non sembra incrementare il rischio di infezioni nel bambino73.
h Un GPO veniva considerato sfavorevole se durante la gravidanza insorgevano complicanze ostetriche nella madre e nel nascituro.
52
Figura 6. Principali reazioni avverse alle tiopurine e loro frequenza.
Reazioni avverse dose dipendenti Frequenza
Emato-tossicità
Pancitopenia 0,4 - 2 %
Leucopenia 3,8 -11,5 %
Trombocitopenia 1,2 %
Epato-tossicità 1 - 10%
Reazioni avverse dose indipendenti Frequenza
Pancreatite 1,2 – 4,9 %
Gastro-intestinali 4,6 %
Simil-influenzali 2 – 6,5 %
Tratto da: Teml A, Schaeffeler E,Herrlinger KR, Klotz U, Schwab M. Thiopurine treatment in inflammatory bowel disease: clinical pharmacology and implication of pharmacogenetically guided dosing.Clin.Pharmacokinet.2007;46(3):187-208.
53
CAPITOLO 4- Lo studio
4.1 Obiettivo
Lo scopo di questo studio è stato di raccogliere e analizzare i dati di pazienti pediatrici affetti da malattie autoimmuni del fegato e delle vie biliari afferenti all’U.O. di Epatologia e Gastroenterologia Pediatrica di Pisa, che tra il 1993 e il 2013 abbiano ricevuto un
trattamento con azatioprina di una durata minima di 6 mesi.
Le finalità specifiche dello studio sono di valutare gli eventuali effetti avversi, legati all’utilizzo dell’azatioprina, in termini di tipologia, gravità e frequenza. Sono state inoltre valutate le correlazioni temporali nello sviluppo degli effetti avversi mielodepressivi nell’ottica di individuare eventuali markers precoci di tossicità farmaco-indotta. Infine è stata analizzato il ruolo della malattia di base e dell’eventuale associazione con MICI come fattore di rischio per lo sviluppo di effetti avversi della terapia prolungata con AZA.
54
4.2 Pazienti e metodi
È stato disegnato uno studio retrospettivo monocentrico per analizzare i dati dei pazienti
con malattie autoimmuni del fegato e delle vie biliari, afferenti all’U.O. di Epatologia e
Gastroenterologia Pediatrica di Pisa, che hanno ricevuto un trattamento con AZA, per una
durata minima di 6 mesi, nel periodo compreso tra il gennaio 1993 e il dicembre 2013.
Sono stati inclusi nello studio i pazienti con diagnosi di EAI-1, EAI-2, EAI sieronegativa, CSA, CSPD e sindrome da overlap; con un’età all’inizio del trattamento con AZA