1.5 Approccio biochimico nello studio dei sistemi di trasporto
1.5.1 La glutammina e la membrana plasmatica
1.5.1.3 B 0 AT1 e la famiglia SLC6
AT1 e la famiglia SLC6
La famiglia SLC6 (Solute Carrier Family 6) appartiene ad una superfamiglia di trasportatori Na+-dipendenti definita NAT, della quale fanno parte trasportatori ritrovati in batteri, insetti ed in organismi eucariotici sia primitivi che superiori. Pare che, inizialmente, questa famiglia si sia evoluta allo scopo di consentire l’uptake di nutrienti ed amminoacidi in organismi unicellulari e pluricellulari; la capacità di trasportare anche neurotrasmettitori, invece, si è evoluta in epoca successiva.
La famiglia SLC è una delle più grandi e nell’uomo comprende circa 20 membri, raggruppati in 4 sottofamiglie: trasportatori delle monoammine, trasportatori del GABA, trasportatori di amminoacidi e trasportatori orfani, così denominati perchè finora non si conosceva il substrato trasportato. L’allineamento di B0AT1 con tutti i membri della famiglia SLC6 ha rivelato che, insieme a XT2 (che probabilmente trasporta glicina) e XT3, esso appartiene alla sottofamiglia dei trasportatori orfani, pertanto anche i “trasportatori orfani” possono essere identificati come trasportatori di amminoacidi. B0AT1 mostra il 51% di identità con XT2 ed il 43% con XT3, mentre con gli altri membri di SLC6 solo il 21%. L’analisi del profilo idropatico ed il modello topologico indicano la presenza di 12 presunti domini transmembrana, con un grosso loop tra il settimo e l’ottavo dominio.
Recentemente la risoluzione della struttura del trasportatore per la leucina (LeuTAa) del batterio Aquifex aeolicus ha permesso di effettuare allineamenti con B0AT1 e B0AT2. Tali allineamenti hanno mostrato una buona omologia, soprattutto a livello delle eliche
1, 6 e 8, mentre non è stato possibile effettuare homology modeling per quanto riguarda il loop tra le eliche 7 e 8, perchè i dati cristallografici del trasportatore batterico non danno informazioni riguardo questa regione. La regione compresa tra le eliche 1 e 6 è risultata essere quella responsabile della formazione del sito di legame per il Na+. Nella struttura di LeuTAa il gruppo carbossilico della leucina contribuisce alla coordinazione dello ione Na+, perciò esiste una sovrapposizione tra i siti di legame per substrato e cosubstrato. Questo potrebbe spiegare la reciproca influenza delle concentrazioni di ioni Na+ e leucina nella valutazione delle Km.
Per quanto riguarda la specificità per i substrati, inizialmente è stato dimostrato che B0AT1 è un uniport di L-leucina, Na+-dipendente e Cl--indipendente. La sostituzione del Na+ con altri cationi, come NMDG (N-metil-D-glucammina) e Li+, non riesce ad evocare un’ attività di trasporto misurabile.
Sono stati condotti, successivamente, esperimenti di flusso, sempre in oociti di X.
laevis, ottenendo il seguente ordine di preferenza:
Met=Leu=Ile=Val>Gln=Asn=Phe=Cys=Ala>Ser=Gly=Tyr=Ther=His=Pro>Trp>Lys. Glutammato ed arginina, invece, non si sono dimostrati inibitori del trasporto della leucina, confermando che non vengono trasportati da B0AT1.
La stechiometria del trasporto è di uno ione Na+ cotrasportato con un amminoacido, come dimostra la dipendenza iperbolica dalla concentrazione di Na+ esterna; la variazione della concentrazione interna di Na+, invece, non pare avere alcun effetto sull’attività di trasporto. È stato, inoltre, dimostrato che l’uptake degli amminoacidi zwitterionici dipende dal potenziale di membrana; l’iperpolarizzazione della membrana cellulare, difatti, aumenta l’uptake di leucina all’interno degli oociti. Alcuni studi, infine, hanno posto l’attenzione sulla dipendenza dell’attività di trasporto dalla concentrazione di ioni H+ presenti all’esterno delle cellule in coltura, osservando una
diminuzione dell’uptake di leucina al diminuire del valore di pH del mezzo esterno e viceversa. Si pensa che l’effetto degli ioni H+ sia quello di una modificazione del trasportatore, nella sua porzione extracellulare, e non di una sua implicazione nel meccanismo di trasporto.
Per quanto concerne la cinetica del trasporto, è stato osservato che B0AT1 non mostra trans-stimolazione e che le Km dei due substrati si influenzano reciprocamente. La Vmax, invece, risulta essere indipendente dalla concentrazione degli ioni Na+, cosa che suggerisce un meccanismo simultaneo di tipo ordinato. Quest’ultima affermazione, tuttavia, non sembra verificata a basse concentrazioni di ioni Na+. Esistono, quindi, conclusioni contrastanti in merito al meccanismo: secondo alcuni studi, B0AT1 funziona con un meccanismo di tipo simultaneo ordinato, legando prima l’amminoacido e poi il Na+; la velocità massima del trasporto, quindi, risulta indipendente dalla concentrazione dell’amminoacido, quando la concentrazione di Na+ è saturante. Altri risultati mostrano, invece, un meccanismo simultaneo random, con una preferenza di legame dell’amminoacido prima del Na+.
Oltre a B0AT1 è stato isolato un altro membro della sottofamiglia dei trasportatori orfani, denominato prima v7- 3 e poi B0AT2 a causa delle sue caratteristiche funzionali molto simili a quelle di B0AT1. B0AT2 come B0AT1, infatti, regola il cotrasporto di uno ione Na+ ed un amminoacido in modo Cl- -indipendente ed elettrogenico. I protoni, inoltre, causerebbero modificazioni conformazionali nella porzione extracellulare del trasportatore, con una diminuzione dell’attività di trasporto al diminuire del pH.
La differenza con B0AT1 riguarda la specificità dei substrati; l’amminoacido trasportato con maggiore affinità, infatti, risulta essere la prolina, con il seguente ordine di preferenza per gli altri amminoacidi zwitterionici: Pro>Leu=Met=Ala=Val≥ Ile>The>Asn=Ser>Phe>Gln. Analisi di RT- PCR mostrano, nel topo, una distribuzione
tissutale ristretta esclusivamente a cervello, polmoni e reni. Il ruolo fisiologico di B0AT2, comunque, resta da chiarire definitivamente, sebbene sembra essere molto plausibile una sua implicazione nel trasporto dei neurotrasmettitori nei neuroni (Broer et al 2004, 2006; Bohmer et al 2005; O’Mara et al 2006; Utsunomiya-Tate et al 1996).