B CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE

Polimorfismo della lunghezza dei frammenti amplificati per PCR (Amplified Fragments Length Polimorphism) è uno strumento basato sulla PCR utilizzate nella ricerca genetica, nel DNA fingerprinting, e nel monitoraggio . Sviluppato nei primi anni del 1990 da Keygene [1], l’ AFLP utilizza due enzimi di restrizione per digerire il DNA genomico, i frammenti vengono poi legati (ligation) ad adattatori appositi. Un sottoinsieme dei frammenti di restrizione è quindi selezionata per essere amplificato. Questa selezione è realizzata usando primer complementari alla sequenza adattatore, ovvero la sequenza del sito di restrizione e di pochi nucleotidi all'interno del frammento del sito di restrizione. I frammenti amplificati sono visualizzati su gel di poliacrilamide denaturante attraverso metodologie autoradiografiche o a fluorescenza.

ii. ARDRA

L’ ARDRA (Amplified rDNA (Ribosomal DNA) Restriction Analysis ) è un’estensione della tecnica del RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) per il gene che codifica per una parte delRNA ribosomiale microbico. La tecnica comporta l’amplificazione PCR con primer delle regioni conservate alle estremità del gene, seguita da digestione con enzimi di restrizione “tetra cutter”. I profili di bandeggi ARDRA sono spesso usati per de replicare gli

130 isolati prima del sequenziamento del rDNA.

iii. ARISA

L’ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) è una tecnica di fingerprint molecolare appliacto alle comunità microbiche basato sul polimorfismo di lunghezza delle regioni spaziatrici dell’operone rRNA (ITS) . I frammenti sono marcati al terminale 5’ e soggetti a corsa in un sequenziatore automatico. La tecnica si basa sul fatto che anche gli ITS , come i 16S rRNA e 26S rRNA, sono in copia multipla. Inoltre, gli TS sono molto più variabili dei geni dell’operone codificanti per le varie sub unità di RNA ribosomale.

iv. FAME

La tecnica FAME (Fatty acid methyl esther) si basa sulla separazione gascromatografica degli esteri di acidi grassi. Può essere effettuata su coltura pura o per definire popolazioni complesse.

v. iSSR

La tecnica iSSR (intra Short sequence Repeat) è sostanzialmente simile ad un RAPD in cui i primer sono costituiti da sequenze micro satellitari ( es GACA GACA GACA GACA, indicato come GACA4). Questo fatto permette di innalzare la Tm e quindi la temperatura di

annealing della PCR producendo risultati più ripetibili di quelli del RAPD.

vi. DGGE/TGGE

Queste due tecniche (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis o Temperature Gradient Gel Electrophoresis) sono finalizzate a stimare il numero di specie partendo dal DNA metagenomico estratto da comunità microbiche complesse. Le sequenze non vengono separate in base al loro peso molecolare, ma piuttosto per la loro composizione complessiva e in particolare di alcuni siti. Infatti, le sequenze ricche di G e di C si denaturatno meno di quelle con A e T in presenza di agenti alcalini e caotropici come l’urea (DGGE) o per effetto della temperatura (TGGE). Gli ampliconi vengono sottoposti a

131 queste particolari elettroforesi da cui risultano sostanzialmente tante bande distinte quante sono le specie presenti nella comunità.

Per l’estrazione di DNA da suolo, il suolo essiccato e vagliato a 2 mm viene conservato a - 40°C o a temperature inferiori. L’estrazione del DNA viene svolta con l’utilizzo dei kit per estrazione di DNA da suolo, utilizzando le istruzioni della ditta fornitrice. Il DNA estratto viene amplificato con primer specifici per il 16S rDNA e gli amplificati vengono clonati direttamente o previa separazione mediante Denaturino Gradient Gel Electrophoresis (DGGE).

I frammenti provenienti dalla scelta random dei cloni o dalle bande elettroforetiche più significative vengono sequenziali, come descritto in Castadini et al. (2005); la collocazione tassonomica degli organismi viene poi eseguita per comparazione con il database di sequenze nucleotidiche disponibile in web (GenBank).

vii. MICROARRAY

L’uso dei microarray è nato per definire con un solo esperimento l’attivazione o la disattivazione trascrizionale di tutti i geni di un genoma. Successivamente, sono stati prodotti vetrini di microarray “tassonomici” contenenti sequenze di specie ben note, per cui quando tali vetrini vengono ibridati con DNA metagenomico marcato si evidenzieranno gli “spot” su cui sono stati deposti i DNA specifici delle specie presenti nella comunità. Il limite di tale sistema è l’incapacità di rilevare o anche di indicare la presenza nella comunità microbica di specie non considerate nel microarray. Altro problema è determinare e ritrovare sequenze specie specifiche da impiegare nella produzione del vetrino.

viii. RAPD

La metodologia RAPD (Randomly Ampliefied Polymorphic DNA) si basa sull’amplificazione casuale di frammenti di DNA con un solo primer abbastanza corto da potersi ibridare frequentemente nel genoma. La tecnica può essere effettuata in “multiplex” impiegando più di un primer in modo da aumentare il numero di bande ottenibili in ogni corsa elettroforetica. Il RAPD è stata una delle prime tecniche di caratterizzazione ceppo

132 specifica ed è tuttora impiegato, anche se la ripetibilità della tecnica non è elevatissima.

ix. RFLP

Questo approccio (Restriction Fragment Length Polymorphism) si basa su una serie di tecniche che mirano ad evidenziare la posizione di specifici enzimi di restrizione lungo il gene. Si hanno tre forme particolari di RFLP:

 restrizione diretta del DNA genomico e corsa su gel d’agarosio colorato con Etidio Bromuro (funziona solo per geni in copia multipla come quelli del rRNA)

 elettroforesi del DNA genomico ristretto e rilievo delle bande specifiche mediante sonde marcate (tecnica del Souther Blot)

 Amplificazione PCR del gene da studiare seguita da restrizione e corsa su gel d’agarosio. Un caso particolare di questa tecnica è l’ARDRA.

x. Sequenziamento

Il sequenziamento di regioni particolarmente discriminanti a livello di specie (16S nei batteri e 26S nei funghi) o a livello di ceppo (ITS) è lo strumento per l’identificazione monofasica e per una caratterizzazione molto particolareggiata a livello di ceppo. Si effettua l’amplificazione delle sequenze marcatrici e poi si sottopongono immediatamente a sequenziamento su entrambi i filamenti.

xi. SSR

Questa tecnica (Short Seequence Repeat) chiamata anche analisi micro satellitare si basa sul fatto che molte regiooni del genoma contengono numeri variabili di brevi sequenze, per cui alleli diversi risultano essere caratterizzati da lunghezze diverse, rilevabili con gli apparati di sequenziamento.

xii. T-RFLP

Come la DGGE e la TGGE, la T-RFLP (Terminal RFLP) è una tecnica finalizzata alla stima del numero di specie diverse in comunità microbiche. Si effettua di solito amplificando la

133 regione 16S o 26S con i normali primer, di cui uno fluorescinato.Dopo restrizione con enzimi a taglio frequente si sottopone il preparato a migrazione in un apparato da sequenziamento. Specie diverse di solito esibiscono siti diversi di restrizione nelle zone sopra dette, per cui dalla presenza di bande di lunghezza diversa si può desumere il numero delle specie presenti.

I metodi sopra riportati sono applicabili alla caratterizzazione o all’identificazione dei vari microrganismi procarioti o eucarioti di interesse agroalimentare e ambientale. Le tabelle nella parte finale di questo capitolo riportano i collegamenti ipertestuali a vario articoli a seconda della combinazione fra tecnica e ambito applicativo o fra tecnica e tipo di organismo da studiare. Ulteriori approfondimenti possono essere trovati sia nella sezione “ulteriori letture” sia nel manuale “Metodi di analisi Molecolare per lo studio dei microrganismi del suolo” a cura della Società Italiana Scienza del Suolo (SISS) e del MiPAF.

Tabella 7: Metodi di identificazione monofasica e caratterizzazione molecolare

Funzione _{Batteri Lieviti e Muffe}

rDNA identificazione B0, B00 L0 AFLP caratterizzazione B1, B2, B3, B4, B7 L1, L2, L3, L4, L5, L39 ARDRA caratterizzazione B6, B8, B9, B10, B11, B12, B13 L6, L7, L8, L9, L10 ARISA caratterizzazione B20, B21, B22, B23 L12, L13, L28, L29, PFGE caratterizzazione B3 L11 DGGE _{caratterizzazione B12, B29} L9,

DNA mitocondriale caratterizzazione L17, L20, L25, L26, L27, L37, L38

FAME caratterizzazione B15, B16, B17,B18, L22, L23, L24,

Interdelta seq caratterizzazione L15, L17, L18, L19, L20, L21,

iSSR _{caratterizzazione B5, B19,} L8, L14,L15, L16, L30, ITS caratterizzazione B3 L4 microarray _{caratterizzazione B24, B30} L41, L42 RAPD _{caratterizzazione B3, B4, B6, B14, B19, B25,} B26, B27 L15, L31, L32, L33, L34, L35, L39 RFLP caratterizzazione B33, B34 L17, L36, L37, L38 SSR caratterizzazione B32 L19, L33, L39, L40 T-RFLP _{caratterizzazione B28, B29, B31} L43

134 Tabella 8: Metodi di identificazione monofasica e caratterizzazione molecolare

Funzione Vino e birra Formaggi e latticini salumi Pane e pr. forno Prodotti vegetali Suolo etc. rDNA identificazione L0, B0, B00 L0, B0, B00 L0, B0, B00 L0, B0, B00 L0, B0, B00 L0, B0, B00 AFLP caratterizzazione _{L1, L2, B7,} L39 L3, B3, L4, B14 B1 B2, L4 B4, L5 ARDRA caratterizzazione B6, B9, L8, B10 L7, B11 B12, L9 B13, L10 B8, L6, ARISA caratterizzazione PFGE caratterizzazione L11 B3 L11 L11 DGGE caratterizzazione B12, L9 B29

DNA mitocondriale caratterizzazione L27, L37 L38

FAME caratterizzazione B18, L22,

L24,

Interdelta seq caratterizzazione L15, L17, L19, L20, L21, iSSR caratterizzazione B5 ITS caratterizzazione L8, L15 B3 microarray caratterizzazione L42 B30 RAPD caratterizzazione _{B6, L32,} B27, L33, L39, L35 B3, B26 L31, B25 B4, L34 RFLP caratterizzazione _{L15, L36,} L37 L38, B33 B33 B34 SSR caratterizzazione _{L19, L33,} L39, L40 T-RFLP caratterizzazione B28 B31 B29, B31

135 4 -LINEE GUIDA PER LA CONSERVAZIONE DEI MICRORGANISMI

In questo capitolo saranno presentate le tre strategie fondamentali per la conservazione della biodiversità microbiologica di interesse agroalimentare ed ambientale con un’analisi critica delle motivazioni per adottarle. Particolare cura sarà prestata agli effetti delle varie forme di conservazione sulla struttura genetica dei materiali conservati. L’ottimizzazione delle procedure per mettere in essere tali progetti di conservazione e un’analisi critica delle modalità attualmente in uso, saranno presentati nella seconda parte del capitolo.