Diversi sono i metodi finora messi a punto che utilizzano anticorpi per il rilevamento e la quantificazione delle PLTX. Tuttavia, gli anticorpi anti-PLTX non sono attualmente disponibili in commercio. Tra questi, due sono quelli meglio caratterizzati per la quantificazione delle PLTX nei mitili. Garet et al., (2010), dopo aver ottenuto un anticorpo anti-PLTX a singola catena (scFv) mediante la tecnica del phage display, hanno sviluppato un saggio immunoenzimatico competitivo di tipo indiretto, basato sull’impiego di tale anticorpo e della PLTX adsorbita alla fase solida. Il metodo di Garet risulta essere sensibile, con un intervallo di lavoro di 0,0005-500 ng/mL e un limite di rilevabilità di 0,5 pg/mL. Analizzando estratti di molluschi, gli autori hanno rilevato un recupero della PLTX piuttosto variabile, senza però determinare il limite di rilevabilità della tossina nei molluschi, l’eventuale capacità dell’anticorpo scFv di individuare analoghi della PLTX e di rilevare altre tossine marine, per dimostrarne la specificità.
In seguito, è stato messo a punto e caratterizzato un saggio immunoenzimatico di tipo non competitivo indiretto, basato sull’impiego di un anticorpo monoclonale anti-PLTX murino (73D3) usato come agente di cattura e di uno policlonale di coniglio come agente di rilevamento. Il saggio si è rivelato accurato, preciso e ripetibile. Il range di linearità della curva di calibrazione è risultato compreso tra 1,25 e 80 ng/mL, con un LoD di 1,1 ng/mL e un LoQ di 2,2 ng/mL. Il saggio, inoltre, è risultato altamente specifico nel rilevare solo analoghi strutturali della PLTX (quali la 42-idrossi-PLTX), ma non altre tossine algali che possono essere co-presenti in campioni naturali. L’analisi di estratti metanolici di mitili, che presentano solo
modeste interferenze con la rilevazione della tossina, ha evidenziato un LoQ pari a 11 ng/mL, corrispondente a 11 μg/kg di polpa. Il saggio è pertanto uno dei pochi metodi che attualmente permettono di quantificare la tossina al di sotto dei limiti suggeriti dall’EFSA (EFSA, 2009). Inoltre, l’analisi di mitili contenenti quantità note di PLTX ha evidenziato un recupero della tossina prossimo al 100 % (Boscolo et al., 2013).
C5.8. Biosensori
Recentemente è stato messo a punto un biosensore ad elettrochemiluminescenza, basato sull’architettura del saggio immunoenzimatico messo a punto da Boscolo et al., (2013). L’elevata sensibilità del biosensore è stata raggiunta coniugando l’anticorpo monoclonale anti-PLTX a nanotubi di carbonio funzionalizzati che hanno aumentato la conduttanza del biosensore (Zamolo et al., 2012). Il biosensore ha un LoD di 0,07 ng/mL e un LoQ di 0,24 ng/mL, che nei mitili corrisponde a 2,2 mg/kg di polpa, ossia circa 15 volte inferiore al limite massimo suggerito dall’EFSA (EFSA, 2009).
Un altro biosensore precedentemente messo a punto è un saggio basato sulla tecnica della
Surface Plasmon Resonance (SPR) e sull’utilizzo dell’anticorpo anti-PLTX 73D3. Il biosensore
è risultato specifico per la PLTX e sensibile (LoD = 0,52 ng/mL), ma non sono presenti informazioni relative alla quantificazione della PLTX nei mitili, ma solo in estratti di vongole e cernie (LoD = 1,4 e 2,8 ng/mL, rispettivamente) (Yakes et al., 2011).
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Serie Rapporti ISTISAN numero di dicembre 2014, 1° Suppl.