Il calcio è uno dei più importanti segnali intracellulari. Alcune
fotoproteine attivate dal calcio rappresentano un metodo vitale e
molto sensibile per la quantificazione del calcio intracellulare in
cellule viventi. La proteina maggiormente utilizzata a questo scopo,
l’aequorina, emette luce in seguito al legame con questo ione.
L’energia necessaria per l’emissione luminosa deriva dalla reazione
ossidativa chemiluminescente del gruppo prostetico covalentemente
legato alla proteina (Fig. 30).
L’uso delle fotoproteine permette così la misura del calcio
intracellulare, l’identificazione di regolatori cellulari primari e
se-condari che agiscono mediante il Ca
2+, la localizzazione del calcio
all’interno della cellula e la valutazione delle sue variazioni.
Conse-guentemente le fotoproteine risultano particolarmente utili nello
studio dei danni cellulari in seguito a stimoli di diversa natura
(farmacologici, elettrici, ecc..). La capacità di alcune cellule di
pro-HO (R1) (R2) R2 (R3) OH OH O O O N N N N N R3 CH2 CH2 Ca2+ NH R1 + CO2 + luce blu
Figura 30. Reazione delle fotoproteine con Ca
2+.durre le proprie fotoproteine, la possibilità di indurne
sperimental-mente la sintesi mediante l’introduzione nella cellule di cDNA o di
mRNA e l’uso di cellule transgeniche aumenta considerevolmente
l’applicabilità di questo approccio alla valutazione del Ca
2+intracellulare. In particolare si apre così la strada all’imaging del
Ca
2+- libero in un gran numero di cellule in vari stadi fisiologici.
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Indice
Editoriale... pag. 3
Introduzione... » 4
1. Classificazione dei fenomeni di luminescenza ... » 4
2. Efficienza delle reazioni chemiluminescenti ... » 8
3. Il segnale analitico... » 9
4. Metodi di misura quantitativi per reazioni
chemilumi-nescenti ... » 11
4.1 Analisi della cinetica delle reazioni chemilumine
scenti ... » 12
5. Il luminometro ... » 14
5.1 Camera di reazione... » 17
5.2 Monocromatore... » 18
5.3 Rivelatori (chimici, termici ed elettrici) ... » 18
5.4 Amplificatore del segnale... » 20
5.5 Registratore e processore dei dati. ... » 20
6. “Low light Imaging” ... » 21
Principali reazioni chemiluminescenti ... » 24
1. Luminolo e suoi derivati... » 24
2. I diossetani ... » 26
3. Esteri di acridinio... » 28
4. Enzimi catalizzanti reazioni chemiluminescenti... » 31
4.1 Sistema luminoso + perossidasi nella
chemilumi-nescenza potenziata... » 31
4.2 Fosfatasi alcalina e β-galattosidasi e diossetani ... » 33
5. Luciferasi della lucciola (firefly) ... » 36
6. Luciferasi batterica... » 39
Applicazioni delle reazioni chemiluminescenti in biologia e
medicina... » 41
1. Immunometria... » 41
1.1 Traccianti marcati con molecole chemiluminescenti.. » 44
1.1.1 Traccianti chemiluminescenti per apteni... » 45
1.1.2 Traccianti chemiluminescenti di natura proteica . » 45
1.1.3 Valutazione dei traccianti chemiluminescenti ... » 46
1.1.4 Traccianti con esteri di acridinio ... » 50
1.1.5 Traccianti con diossetani in
termochemilumine-scenza ... » 51
1.2 Traccianti marcati con enzimi catalizzanti reazioni
chemiluminescenti... » 52
1.2.1 Sistema luminolo-perossidasi-enhancers... » 52
1.2.2 Sistema diossetani-fosfatasi alcalina... » 52
2. Applicazione della luminescenza alla tecnologia del DNA
ricombinante ... » 54
3. ATP e cofattori ... » 55
4. Reporter genes ... » 55
5. Fagocitosi... » 56
6. Calcio intracellulare ... » 57
Bibliografia... » 58
Testi consigliati ... » 59
Indice ... » 60
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