Campionamento acque dolci 1 Prima fase di campionamento

La prima fase di campionamento, mirata alla raccolta della maggior quantità possibile di specie di Efemerotteri, è stata effettuata tra Maggio 2012 e Aprile 2014 in fiumi e torrenti dell’area mediterranea. I siti oggetto dello studio sono stati considerati nelle regioni del centro Italia (Toscana e Lazio) e nelle principali isole tirreniche (Sardegna, Elba e Corsica) (Fig.12).

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La raccolta è stata effettuata con un retino immanicato effettuando la tecnica del “kick sampling” (ovvero smuovendo il substrato di fondo direttamente con il piede per circa due minuti) e si è concentrata esclusivamente sulle larve di Efemerotteri. Il materiale raccolto è stato smistato in sito attraverso l’utilizzo di apposite bacinelle e successivamente conservato in provette contenenti alcol etilico non denaturato al 95%. Quando possibile si è cercato di recuperare tre esemplari per ciascuna specie.

La fase di identificazione morfologica è stata effettuata presso il laboratorio di ecologia delle acque dolci (Università Degli studi della Tuscia) attraverso uno steroscopio Leica S8APO o un microscopio ottico OLYMPUS CH, utilizzando apposite chiavi di identificazione (ad esempio Belfiore 1983). Il dataset finale conta 91 individui corrispondenti a 39 specie morfologicamente riconosciute (18 generi, 8 famiglie) (Tab.2).

Tab.2 - Lista dei campioni analizzati con la relativa nomenclatura tassonomica in accordo con Fauna Europea (aggiornata al 29 Agosto 2013 | versione 2.6.2), siti campionati e numero di accessione in GeneBank delle sequenze COX1 prodotte in questo studio.

Famiglia Genere Specie Località N° Access. Baetidae Baetis albinatii Sartori & Thomas Siligo, Sardinia LN734680 muticus Linnaeus Vitozza, Tuscany LN734678 vernus Curtis Treja, Latium LN734679 cyrneus Thomas & Gazagnes Villanova Tulo, Sardinia LN734681 Posada, Sardinia, specimen 1 LN734682 Posada, Sardinia, specimen 2 LN734683 Posada, Sardinia, specimen 3 LN734684 lutheri Müller-Liebenau Meleta Pitigliano, Tuscany LN734685 Aquarella Tuscania, Latium LN734686 fuscatus Linnaeus Lunevara, Sardinia LN734687 Rio Mannu, Sardinia LN734688 alpinus Pictet Fosso di Galantina, Latium LN734689 Aniene, Latium LN734690 Obito, Latium LN734691 buceratus Eaton Mola di Oriolo, Latium, specimen 1 LN734692 Riofi, Tuscany LN734693 Soriano nel Cimino, Latium LN734694 Mola di Oriolo, Latium,specimen 2 LN734695 Mola di Oriolo, Latium, specimen 3 LN734696 Centroptilum luteolum Müller Rafanello, Latium LN734697 Fosso Tancia, Latium LN734698 Fosso di Galantina, Latium LN734699 Procloeon pulchrum Eaton Vitozza, Tuscany LN734700 Ortolano, Latium LN734701 Rio Chiaro, Latium LN734702 bifidum Bengtsson Mignone Montericcio, Latium LN734703 Seccheto, Elba Island LN734704 Torrente Leni, Sardinia LN734705 Cloeon dipterum Linnaeus Mignone Canale Monterano, Latium LN734706 Aquarella Tuscania, Latium LN734707 simile Eaton Tirso, Sardinia LN734708

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Caenidae Caenis pusilla Navas Mignone Montericcio, Latium LN734709 Aquarella Tuscania, Latium LN734710 beskidensis Sowa Vitozza, Tuscany LN734711 Rio Chiaro, Latium LN734712 Aquarella Tuscania, Latium LN734713 martae Belfiore Mola di Oriolo, Latium LN734714 Ortolano, Latium LN734715 Riofi, tuscany LN734716 sp. Tirso, Sardinia LN734717 Brachycercus harrisella Curtis Vitozza, Tuscany LN734718 Rio Chiaro, Latium LN734719 Heptageniidae Ecdyonurus helveticus Eaton Fosso Tancia, Latium LN734720 Ortolano, Latium LN734721 Meleta Collina, Tuscany LN734722 corsicus Esben-Petersen Rio Tistigliosi, Sardinia LN734723 venosus Fabricius Ortolano, Latium, specimen 1 LN734724 Introvabile, Latium LN734725 Mignone Canale Monterano, Latium LN734726 Ortolano, Latium, specimen 2 LN734727 Epeorus assimilis Eaton Obito, Latium LN734728 Aniene, Latium LN734729 Ortolano, Latium LN734730 Electrogena grandiae Belfiore Introvabile, Latium LN734731 Rafanello, Latium LN734732 zebrata Hagen Rio Mannu, Sardinia LN734733 Padru Rio de su Lernu, Sardinia LN734734 Rhithrogena semicolorata Curtis Mignone Canale Monterano, Latium LN734735 Fosso Tancia, Latium LN734736 Rio di Sesto, Trentino LN734737 reatina Sowa & Belfiore Velino Antrodoco, Latium LN734738 Velino Canetra, Latium LN734739 nuragica Belfiore Rio Aratu, Sardinia LN734740 insularis Esben-Petersen Restonica, Corse LN734741 Murzo, Corse LN734742 eatoni Esben-Petersen Murzo, Corse LN734743 Heptagenia longicauda Stephens Rigomero, Latium LN734744 Aquarella Tuscania, Latium LN734745 Rio Chiaro, Latium LN734746 Leptophlebiidae Habroleptoides confusa Sartori & Jacob Fosso di Galantina, Latium LN734747 Rafanello, Latium LN734748 Ortolano, Latium LN734749 sp. Rio Tistigliosi, Sardinia LN734750 Habrophlebia eldae Jacob & Sartori Vitozza, Tuscany LN734751 Fosso Arlena, Latium LN734752 Rafanello, Latium LN734753 Paralaptophlebia submarginata Stephens Aquarella Tuscania, Latium LN734754 Vitozza, Tuscany, specimen 1 LN734755 Vitozza, Tuscany, specimen 2 LN734756 Choroterpes picteti Eaton Mignone Montericcio, Latium LN734757 Ephemerellidae Serratella ignita Poda Vitozza, Tuscany LN734758 Rafanello, Latium LN734759 Fosso Arlena, Latium LN734760 Ortolano, Latium LN734761 Oligoneuridae Oligoneuriella rhenana Imhoff Meleta Pitigliano, Tuscany LN734762 Rio Chiaro, Latium LN734763 Siphlonuridae Siphlonurus lacustris Eaton Vitozza, Tuscany LN734764 Velino Antrodoco, Latium LN734765 Ephemeridae Ephemera danica Müller Vitozza, Tuscany LN734766

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5.1.2 Seconda fase di campionamento

Nella successiva fase, gli sforzi di campionamento si sono concentrati sulla raccolta di macroinvertebrati bentonici, utilizzati come biondicatori di stato ecologico delle acque. Sono stati campionati tre siti: sul torrente Biedano in località Barbarano Romano (VT), Monteromano e sul torrente Traponzo provincia di Viterbo, nel mese di Ottobre 2015. I siti di campionamento (Fig.13) sono stati selezionati sulla base del gradiente qualitativo dell’acqua atteso, il primo trovandosi nel tratto alto, non sottoposto a particolari pressioni antropiche, l’ultimo posto alla confluenza di un affluente soggetto agli scarichi della città di Viterbo e il secondo in situazione intermedia.

Fig.13 - Siti dei 3 campionamenti per l’analisi NGS

In questa fase è stato raccolto tutto il materiale di macrobentos presente, conservato immediatamente con le stesse modalità riportate per la fase precedente. Successivamente il materiale è stato identificato in laboratorio, con gli strumenti utilizzati nella fase precedente e chiavi di determinazione apposite (Belfiore 1983; Sansoni 1988; Campaioli et al. 1994, 1999; Tachet et al. 2006). Ogni individuo è stato misurato su carta millimetrata durante l’identificazione, in modo da avere un riferimento per la normalizzazione dei risultati una volta ottenute le sequenze.

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Il dataset finale conta 455 individui raggruppati in 26 famiglie, 13 generi, in 115 esemplari si è arrivati alla specie come mostra la tabella riportata in Appendice II.

Contemporaneamente, sono stati raccolti dei campioni di sedimento nella zona di pool della prima stazione campionata al fine di verificarne un’eventuale presenza di DNA e posizionati in 3 tubi Falcon da 50 ml posti in congelatore a -20° C entro un paio di ore dal campionamento.

Infine, nella medesima zona di pool, sono stati raccolti campioni di acqua e conservati in una tanica da 5L. In seguito, questi sono stati sottoposti ad una procedura di filtraggio utilizzando una pompa a vuoto. Un primo filtraggio è stato effettuato con un filtro “Glass- Microfibre Discs” Di 4.7 cm di diametro ed una maglia di 2.7 micron, successivamente lo stesso campione di acqua è stato filtrato con un filtro del medesimo diametro ma con una maglia di 1.6 micron ed infine la stessa procedura con un filtro a maglia di 0.45 micron. Tutti i filtri con gli altri campioni ricavati sono stati conservati in congelatore a -20° C fino al momento della fase di estrazione del DNA.

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