solo CLIA+
blot+
Doppi+
blot+
APS
9
0/7
0/1
1/1
ABO
7
0/2
?/3
2/2
TVP
8
1/6
1/1
2/2
TA
4
0/3
0/1
0/0
TR-EPARINA
1
0
0
1/1
Totale con trombosi
29
1/18 (5,5%) 1/3 (33,3%) 6/6 (100%)FA
4
0/2
0/1
1/1
CONTR-EPARINA
2
0/2
0
0
SANI
1
0/1
0
0
Totale controlli
7
0/5 0/1 1/1 (100%)TOTALE GENERALE
36
1/23 (4,3%) ?/7 (?%) 7/7 (100%) Abbiamo potuto vedere che tutti i sieridoppi positivi, sia per
l’immunofluorescenza che per la chemioluminescenza, si sono confermati positivi anche per i blot. Abbiamo quindi ottenuto una concordanza, tra i doppi e i tripli positivi, pari al 100%.
Analizzando invece i sieri con sola positività in chemioluminescenza, uno solo è risultato positivo in immunoblot. Si tratta di un paziente con trombosi venosa profonda il cui quadro fluoroscopio corrispondeva ad un centromerico ad alto titolo [Fig 8], quadro che potrebbe nascondere la positività per DFS70.
Altri 3 sieri positivi solo per la chemioluminescenza, e non per l’immunofluorescena, sono risultati negativi in immunoblot, riportano però valori di CLIA appena sopra il cut off indicato dall’azienda produttrice del test. E’ bene osservare che invece, si tratta di positività elevate quelle dei sieri che risultano essere tripli positivi. Abbiamo inoltre Fig.8 Pattern fluoroscopio Nucleare Centromerico (AC-3) o Centromerico
sono sieri che hanno la positività o per SSA e/o per Ro52 e positività per RNP.
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI:
La determinazione degli ANA costituisce uno dei marcatori di malattia autoimmune da più tempo entrato nell’uso clinico, prototipicamente come criterio classificativo/diagnostico per il LES e per altre malattie autoimmuni sistemiche, ma anche per malattie autoimmuni d’organo (es. epatiti autoimmuni). In realtà fin dall’introduzione in diagnostica degli ANA è risultata evidente l’eterogeneità del marcatore, ovvero la molteplicità degli autoantigeni implicati nella positività ANA: la prima espressione di tale eterogeneità è stata l’individuazione di molteplici pattern fluoroscopici, che nel tempo si è cercato di caratterizzare in sempre maggior dettaglio: ad oggi il numero dei pattern fluoroscopici caratterizzati è dell’ordine delle decine, e il numero delle specificità autoantigeniche note è dell’ordine del centinaio, ma solo per una parte (non maggioritaria) è dimostrata una correlazione clinica utile ai fini diagnostici. Il progresso tecnologico (maggior sensibilità nella rilevazione del segnale fluoroscopico, espansione e miglioramento qualitativo delle metodiche volte a caratterizzare singole specificità antigeniche/associazioni di specificità antigeniche) ha indubbiamente contribuito a incrementare la disponibilità di informazioni, e a rendere più complesso il quadro di insieme. A ciò si aggiunga il fatto che nella formulazione attuale il termine “ANA” (in origine, “anticorpi anti-nucleo”), riferito all’uso delle metodiche in Immunofluoerscenza indiretta su cellule HEP-2. è evoluto comprendendo anche la messa in evidenza di quadri fluoroscopici citoplasmatici (quindi, “anticorpi anti-antigeni intracellulari”), correlabili ad ulteriori situazioni cliniche,
Resta la considerazione fondamentale che la grande maggioranza dei molteplici quadri di malattia correlabili a positività ANA è a relativamente bassa prevalenza, mentre già da studi condotti un ventennio fa sappiamo che la prevalenza degli ANA nella popolazione generale è relativamente elevata. Quindi 1) esistono quadri fluoroscopici e specificità antigeniche ANA non correlate a quadri di malattia definiti 2) esiste comunque un’alta prevalenza di ANA “inaspettata” (in soggetti apparentemente senza segni, o con segni minimi di malattia) che pongono problemi di potenziale overdiagnosi, gestione clinica e di follow-up (62).
Come si è esposto nella parte introduttiva e come confermato dai dati ottenuti dallo studio della presente casistica multicentrica, il pattern fluoroscopico “Dense Fine Speckled” e la positività per
l’autoantigene DFS 70 sono frequenti e danno conto di una parte consistente delle positività ANA “inaspettate” e comunque senza un corrispettivo clinico chiaramente definito. E’ quindi importante, anche per la pratica diagnostica, il tentativo di definirne il significato, e sono necessarie conferme su numeri significativi per avvalorare ipotesi in merito. Una serie di studi pubblicati (v. Introduzione) hanno ipotizzato correlazioni con svariate situazioni patologiche, quali malattie immuno-mediate a patogenesi non chiara, o malattie neoplastiche, ma senza raggiungere in nessun caso risultati di valore definitivo. E’ stato inoltre preso in considerazione il possibile significato della positività anti-DFS70 come marcatore “negativo” di patologia autoimmune sistemica: di fatto, la monospecificità per anti-DFS70 sembra evento raro nei pazienti con ARD, ed è emersa la proposta di escludere, in caso di monospecificità anti-DFS70, il valore degli ANA come criterio diagnostico per LES (5)
Nello specifico dello scopo del presente lavoro, si è voluta indagare in maniera rigorosa l’ipotizzata relazione tra positività per autoanticorpi anti-DFS70 e trombofilia. Ricordiamo che i dati numericamente più consistenti a sostegno dell’esistenza di tale relazione derivano da uno studio su una casistica numericamente abbastanza consistente, ma monocentrica e comunque basata sui soli risultati della valutazione del pattern fluoroscopico, senza indagini con metodiche di conferma della positività anti-DFS 70. I criteri metodologici su cui si è basato il presente protocollo (studio multicentrico con raccolta di siero da 413 soggetti con eventi trombotici non post-traumatici, e da 220 controlli – donatori sani o soggetti in terapia anticoagulante a scopo profilattico, uso di metodologie multiple per evidenziare la specificità anti-DFS 70) sono stati volti a superare tali limiti.
I risultati ottenuti sono in qualche modo concordanti con lo studio francese precedentemente pubblicato: se infatti (ma impropriamente) prendiamo in considerazione tutte le positività in termini di pattern fluoroscopico, il gruppo di trombosi ha una frequenza doppia rispetto i controlli, raggiungendo la significatività statistica, la percentuale di positività nel gruppo del paziente con complicanze ostetriche è maggiore rispetto a tutti gli altri gruppi di patologia e controlli. (Tabella 6).
Tabella 6. Conclusioni improprie
Peraltro queste conclusioni risultano improprie, in quanto dai dati ottenuti risulta evidente che solo una parte dei pattern fluoroscopici Dense Fine Speckled risultano confermati da metodiche autoantigene-specifiche. Se prendiamo in considerazione solamente i casi con positività per anti- DFS 70 confermata con test antigene-specifici (doppi positivi), le differenze osservate tra campione di pazienti in esame e controlli non raggiungono la significatività statistica.
Quindi, questo studio, condotto su numeri elevati di campioni selezionati con criteri stringenti e confrontati con gruppi di controllo appropriati non permette di confermare l’esistenza di una relazione significativa tra positività per anti-DFS 70 e trombofilia. Nel contempo, evidenzia come il pattern fluoroscopico Dense Fine Speckled solo in una parte di casi sia indicativo di positività per anti-DFS 70.
Quindi, il significato clinico di questa positività rimane ancora elusiva: questo studio conferma la sua prevalenza relativamente elevata e l’importanza della sua individuazione, in quanto probabile “non-criterio” di ARD (anche se non vi sono le condizioni per definirlo criterio di esclusione). Resta il problema della definizione delle ulteriori possibili specificità autoantigeniche legate al pattern fluoroscopico Dense Fine Speckled, e in aggiunta del possibile significato della specificità anti-DFS 70 quando associata a altre specificità ANA significative sul piano patogenetico e diagnostico. La disponibilità e il consolidamento nell’uso delle metodiche specifiche (metodiche di secondo e terzo livello) impiegate nel presente studio potrà contribuire a fornire risposte a queste problematiche.
DFS70 + DFS70 - Marginal Row Totals
pz con trombosi 29 (23.49) [1.29] 384 (389.51) [0.08] 413
pz controllo e sani 7 (12.51) [2.43] 213 (207.49) [0.15] 220
Marginal Column
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